Survivin siRNA对卵巢癌细胞侵袭的影响

[摘要] 目的：探讨survivin靶向小分子干扰RNA（siRNA）对卵巢癌细胞侵袭的影响。方法：在survivin基因的编码区内根据干涉位点的设计原则，体外转录合成survivin siRNA，转染人卵巢上皮性癌细胞株SKOV3细胞，用Western blot方法鉴定干涉位点对survivin基因蛋白的干扰效果；细胞侵袭实验（transwell）检测细胞体外侵袭能力的变化。结果：survivin siRNA能有效抑制survivin蛋白的表达，siRNA组survivin蛋白的相对表达水平分别与空白对照组、非特异性组相比，差异均有统计学意义（P

[关键词] 干扰RNA；卵巢癌；SKOV3细胞；survivin基因；转移

[中图分类号] R737.31[文献标识码]A [文章编号]1674-4721（2011）04（b）-０10－０2

Effect of survivin siRNA on the invasive capacity of ovarian carcinoma cells

LI Yan’e1, LU Yanming2, WANG Ning2

1.The Hospital of Yimin, Liaoning Province, Shenyang 110122, China; 2.Shengjing Hospital of China Medical University, Liaoning Province, Shenyang 110004, China

[Abstract] Objective: To investigate the effects of RNA interference (RNAi) targeting survivin gene on the invasive capacity of SKOV3 cells. Methods: Template sequence for survivin siRNA was designed and synthesized. Lipofectamine 2000 mediated transient transfection was conducted to transmit the siRNA into SKOV3 cells. The survivin gene expression was assessed by Western blot assays. Changes of invasive capacity of SKOV3 cells were measured by transwell. Results: Sequence specific siRNA targeting survivin down-regulated the expression of survivinprotein markedly after the transfection. There was a significant difference between survivin siRNA transfected group and other groups(P

[Key words] RNAi; Ovarian carcinoma; SKOV3 cells; Survivin gene; Metastasis

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是原发现存在于真核生物体内的一种自我保护现象，能降解外源导入或病毒基因所表达的mRNA，因此，高效特异地阻断基因的表达是RNAi的一大特征[1-2]。卵巢上皮性癌是女性生殖器恶性肿瘤中的病死率最高的恶性肿瘤，尽管目前生存率有所提高,但由于卵巢癌化疗耐受和转移复发等特点，预后仍不乐观。因此，探索有效的肿瘤的生物治疗辅助方法，提高卵巢癌的治愈率，成为目前研究热点。本研究拟应用RNAi技术，合成针对survivin基因的特异性小分子干扰RNA（siRNA），转染卵巢癌细胞株SKOV3细胞，探索siRNA对卵巢癌细胞侵袭的影响。

1材料与方法

1.1材料

卵巢癌SKOV3细胞株购于中国医学科学院基础医学研究所；lipofectamine 2000及TRIzol购于Invitrogen公司，逆转录酶体系购于Promega公司，耐热DNA聚合酶购于Takara公司，脱氧核苷三磷酸购于上海生工生物工程有限公司。兔抗Survivin多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司。

1.2针对survivin基因的siRNA的设计和制备

设计siRNAs：依据Ambion公司提供的设计原则，根据survivin基因在GenBank中序列设计相应的siRNA。结果用BLAST检索，确认所设计siRNA序列的惟一性。人工合成针对11957-11977nt位碱基靶序列的2条寡核苷酸链。siRNA转录模板由上海博亚公司合成。

特异性siRNA序列：

sense: 5’-CGCAGUUUCCUCAAAUUCUUUUU -3’

antisense: 5’-AAAGAAUUUGAGGAAACUGCGUU-3’

非特异性siRNA序列：

sense: 5'-GUUUGGUAAAUGACAGGCUUU-3'

antisense: 5'-AGCCUGUCAUUUACCAAACUU-3'

1.3细胞培养、转染siRNA

将SKOV3细胞培养达70%融合时，转染siRNA。实验分为3组：①survivin-siRNA转染组；②不加siRNA转染组；③非特异性survivin-siRNA转染组；实验均行3次，取其均值。

1.4检测survivin蛋白的表达

经4% SDS裂解后，提取SKOV3细胞总蛋白。分别取各组总蛋白300 μg，经10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转聚二氟乙烯膜。与特异性单克隆一抗37℃温育2 h，4℃过夜。与二抗（碱性磷酸酶标记）室温孵育2 h后，碱性磷酸酶显色，观察。以survivin蛋白/肌动蛋白的吸光度值（A）的比值作为survivin蛋白的相对表达水平。

1.5测定SKOV3细胞的侵袭能力

制备NIH3T3条件培养液;用Matrigel包被基底膜；接种、培养细胞；固定及染色;每个样本计数10个400倍视野取其均值。

1.6统计学方法

用SPSS 13.0统计学软件进行分析。计量资料统计结果以（x±s）表示，3组间比较采用单因素方差分析，以P

2结果

2.1 Western blot 检测结果

干涉后检测到蛋白表达明显减弱，survivin-siRNA转染组与非特异性survivin-siRNA转染组、空白对照组的蛋白阳性表达率分别为（32.41±0.59）%、（57.49±0.37）%和（58.34±0.46）%。survivin-siRNA组与其他组相比，差异有统计学意义（P0.05），见图1、2。

C：空白对照组；N：非特异性siRNA转染组；S：survivin-siRNA转染组

2.2 细胞侵袭实验

通过检查细胞穿过Matrigel的能力反映出该细胞的侵袭能力。空白对照组侵袭细胞的相对数目为16.63±1.28，非特异性survivin-siRNA转染组的相对数目为15.83±1.23，survivin-siRNA转染组侵袭细胞的相对数目为4.26±0.91，见图3。经F检验得出特异性survivin-siRNA转染组侵袭至滤膜下面的细胞数低于其他组，差异有统计学意义（P

3讨论

细胞凋亡抑制因子（inhibitor of apoptosis，IAP）家族是结构上具有1个或多个高度保守的约70个氨基酸重复序列的一类抗凋亡蛋白，普遍存在于病毒和哺乳动物细胞等生物中[3]。1997年Ambrosini 等在人类基因文库中进行筛选，克隆出survivin基因，可以选择性地表达于肿瘤组织，并具有抑制细胞凋亡的作用[4-6]。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术是最近用于研究基因功能和基因治疗等方面的新技术，具有抑制作用强、稳定性高等优点[7]。本研究采用RNA干扰体外转录体系，合成针对特异性的survivin-siRNA，由脂质体介导转入卵巢癌SKOV3细胞中，运用Western blot的方法检测到在转染特异性的siRNA后survivin蛋白的表达降低，在转染非特异性的siRNA及未转染的细胞中survivin 蛋白未见改变。表明设计的特异性survivin-siRNA可以特异性的干涉肿瘤细胞中survivin基因的表达，这为后续研究survivin基因的功能提供了前提。survivin在肿瘤细胞中有特异性表达，而用RNAi技术可以明显抑制目的基因的表达，这就为肿瘤的基因治疗提供了极为有利的条件[8-9]。

侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特征，已有研究表明survivin的表达与组织病理分级、临床分期密切相关[10]。 Yamamoto TR 等[11]的研究表明，survivin在结直肠癌和乳腺癌的转移淋巴结中的表达率，分别为77%和86%，而且在HE染色没有显示的微转移病变中survivin为阳性表达。提示survivin的表达可能与肿瘤细胞的侵袭与转移有关。笔者通过对抑制survivin表达的SKOV3细胞的侵袭力实验发现，实验组细胞的侵袭力明显低于对照组，说明阻断survivin的表达降低了SKOV3的侵袭力。提示survivin可能参与了肿瘤细胞侵袭力的调节，具体机制尚不清楚。

RNAi的发现改变了人们对细胞基因调控的传统理解,提供了特异性阻断基因表达、评价基因功能的新策略。siRNA是RNAi作用中不可缺少的重要环节，这一发现进一步揭示了RNAi的作用机制。高效特异性的SiRNA干涉作用为哺乳动物细胞的基因治疗开创了新的道路。

[参考文献]

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（收稿日期：2011-02-16）