山西省蔬菜斑潜蝇发生的调查及快速鉴定

摘 要：对山西省蔬菜斑潜蝇的发生进行了调查，并通过对线粒体DNA（mtDNA）的 COI 基因序列的扩增与测序，运用最大简约法构建系统树，对斑潜蝇属的3个种18个样本进行了快速鉴定。此方法为快速准确地鉴定提供了一个新的参考途径。

关键词： 斑潜蝇；系统树；快速鉴定

中图分类号：Q969.44 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.10.022

Survey on Liriomyza in Shanxi and Its Rapid Identification

KANG Yu-guang，QIN Zhuo

（Shuozhou Vocational Technology School， Shuozhou， Shanxi 036002， China）

Abstract： The distribution of Liriomyza in Shanxi was investigated， and 18 samples of 3 species in the genus Liriomyza had been sequenced to obtain the data of mtDNA COI sequences for its identities. Combining both our data and those from Genbank， phylogenetic trees with most parsimony were constructed. The method is helpful for rapid identification.

Key words：Liriomyza； phylogenetic trees；rapid identification

斑潜蝇属潜蝇科（Agromyzidae），斑潜蝇属（Liriomyza） ，全世界已知300多种，主要分布于温带地区。绝大多数种类以潜叶方式取食危害植物，其中具有重要经济意义的种类是多食性种类，有10余种，但危害严重的有4种[1-3]，分别为：美洲斑潜蝇（Liriomyza sativae Blanchard）、南美斑潜蝇（Liriomyza huidobrensis Blanchard）、三叶草斑潜蝇（Liriomyza trifolii Burgess）和番茄斑潜蝇（Liriomyza bryoniae Kaltenbach）。其寄主范围可达14～29科的上百种植物[4-6]，是世界上许多国家和地区蔬菜、瓜类、花卉、烟草及某些中药材的重要害虫，有些种类是世界公认的检疫害虫[5，7]。

1 材料和方法

1.1 材 料

在山西省太原、临汾、五台山的菜田，对14种寄主植物进行调查。从田间采回带有潜叶蝇幼虫或蛹的寄主叶片，将其放入一次性塑料杯中，用纸巾将口封住并用橡皮筋扎紧，置于室内养虫箱中饲养，温度控制在（25±1） ℃之间，相对湿度在60%～80%之间，让其化蛹、羽化。待羽化24 h后，用细毛笔蘸100%的酒精，将已羽化的潜蝇成虫收集到IMEC管中，并用100%的酒精浸泡，放置于-20 ℃的冰柜中保存，待用。

1.2 鉴定方法

1.2.1 形态鉴定 将浸泡在100%酒精中的样本取出，根据成虫形态特征（中鬃排列行数、前翅翅脉形状、体长、体型、体色）、取食习性和幼虫体色、后气门突开口数、化蛹部位、化蛹方式、蛹的颜色等来判定。

1.2.2 快速鉴定 利用通用引物C1-J-1535（5’-ATT GGA ACT TTA TAT TTT ATA TTT GG-3’）和TL2-N-3014（3’-TCC ATT GCA CTA ATC TGC CAT ATT A-5’）对线粒体COI基因进行PCR扩增，将扩增产物纯化并测序，最后对测序结果进行校对和拼接，利用网络同源序列搜索引擎BLAST对GenBank中的同源序列进行比较，通过该基因片段确定所属种类。

1.3 数据分析

本研究中的物种鉴别特别重视形态学与DNA信息的结合。鉴别包括了可验证的下列步骤：（1）初步鉴别到物种，并选定测序样本；（2）在不告知物种信息的前提下测序，并将序列与公共数据库进行比较，找到该序列最近的类群；（3）分类学家和分析人员对结果进行比较、相互验证；（4）得出最终的分类鉴别结论。

DNA分类学的基本流程如下：从所获取的个体上得到组织样品，然后进行DNA提取；将得到的DNA作为后续研究的样品，通过扩增，得到用于基因测序的一个或数个基因片段；而结果得到的基因序列将成为最初的一个鉴定标记，用于判断样品所取个体的物种属性。这样的序列将被整合到合适的数据库中。序列和标本及相应的DNA作为以后工作的参考标准，会被储藏到标本馆（或博物馆）中。一旦一个重要序列的数据库构建完成，新的样品将会与现存序列进行比对从而完成物种的再次鉴定或判断一个新的物种描述是否合理。数据库还可以用来解决一些问题。

2 结果与分析

2.1 发生调查

通过在山西省太原、临汾、五台山等地的调查，发现在山西蔬菜田主要有3种斑潜蝇，它们分别是：美洲斑潜蝇Liriomyza sativae Blanchard、南美斑潜蝇Liriomyza huidobrensis（Blanchard）、葱斑潜蝇Liriaimyza chinensis（Kato）。其中前2种斑潜蝇是从国外陆续传入我国并在蔬菜上危害的，葱斑潜蝇主要分布在亚洲。在山西省多数蔬菜上发生且危害较重的是美洲斑潜蝇。

2.2 斑潜蝇快速鉴定

从图1中可以看出，供试的样本中一共有2种斑潜蝇，分别是美洲斑潜蝇Liriomyza sativae、南美班潜蝇 L. huidobrensis。在分子鉴别之后，又对这些样本进行了形态学的鉴定，并对这两个结果进行了对比。除样本ZHY113和ZHY135外，其余样本的分子鉴定结果与形态学鉴定结果相吻合，但是样本ZHY113和ZHY135的结果却不一致，从图1中可以看出，样本ZHY113和ZHY135分别是南美班潜蝇和美洲斑潜蝇，而形态学鉴定的结果却说明这两个样本都是葱斑潜蝇。

3 结论与讨论

斑潜蝇中的部分种类属于世界范围内的检疫性害虫，如美洲斑潜蝇、南美斑潜蝇、三叶草斑潜蝇等，它们容易随着寄主植物及其包装铺垫物等进行远距离传播扩散，所以当在某一地区发现时，需要在短时间内对其进行快速、准确鉴定并加以控制。但该属中有部分种类在形态上极为相似，即使专业分类学家在进行鉴定时也有一定困难。而如果不能进行快速和准确的鉴定，就会错过防治的最好时机，也会给防治工作带来困难，甚至造成防治的失误，带来一定的经济损失。

DNA分类学可在一定程度上解决这一难题。传统分类学家在鉴别物种时通常使用多个形态学性状，并且越来越多的学者还辅以来自DNA等其他方面的信息，来提高鉴别体系的可靠性；相反，DNA条形码技术则以一个600 bp左右的线粒体DN段来建立鉴别体系[8]。DNA条形码技术准确鉴别程度可以达到98%～100%，并成功应用到北美的鸟类[9]、澳大利亚的鱼类[10]、亚热带的鳞翅目[11]，帮助分类学家鉴别出了隐存种，并逐渐在传统分类学、系统发育与种群遗传学中发挥着作用[12]。与传统的分类方法相比，DNA分类具有快速、准确、实验材料广泛（成虫、蛹、幼虫或残缺的标本）等特点，在没有专业分类学家在场的情况下也可对样品进行较为准确的鉴定。然而，我们也注意到该技术的缺陷：线粒体基因为母系遗传，某些因素如Wolbachia，可能导致这些基因在不同生物物种之间的转移，从而导致根据线粒体基因片段建立的物种鉴别体系不能反映真正自然的物种之间的关系[13]。而且，小范围地区或有限的取样可能导致错误估计物种之间的变异[8， 14]。所以，在设计准确鉴别体系的方案时，必须考虑取样的大小，并同时考虑线粒体DNA和核糖体DNA。

但DNA分类也存在着一些问题。首先，DNA分类还并非是一种低成本的技术，它可能会将一些在资金和技术上存在困难的分类学家排斥在外[15]；其次，选择哪一段序列用于分析，目前还未达成共识；而对这些序列的比对也将面临多方面的困难[16]。如果种类的亲缘关系过近，任何基因都可能变得无用[17]。且从不同的基因组（核基因组或细胞器基因组）中选取的序列可能会得出不同的分类结果[18]。

参考文献：

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