牛血红蛋白α链与β 链多肽生物活性的构效关系

【摘要】牛血红蛋白深受生物医药研究者们的青睐，有很多引人注目的生物活性，如抗菌活性，ACE抑制活性，阿片样活性，增强血管舒缓激肽作用，镇痛活性等。本文讨论了牛血红蛋白中不同的多肽的一级结构与其生物活性的关系。牛血红蛋白生物活性肽将为生物医药领域提供新的应用。

【关键词】生物活性；多肽；α链和β链；牛血红蛋白

【中图分类号】R425【文献标识码】V【文章编号】1005-0515(2011)03-0002-03

1 前言

血红蛋白在动物血管系统中有显著生理作用，运输氧气，直接或间接参与二氧化碳的运载，调节血液PH值，它还可以把毛细血管中的氢离子转移到肺部。此外，它也参与很多疾病，如白血病、贫血症、心脏病及失血过多症等。另外，血红蛋白作为血液替代品也受到很多人的广泛关注，生物相容性好、没有感染危险及长久的保存时间等。

牛血红蛋白（BHb）是由两个α亚基和两个β亚基构成的四聚体球蛋白，与人类的血红蛋白氨基酸序列有90%相似性，并有一定的特性。BHb是比人类血红蛋白更好的氧载体，它与氧结合时放热较少，并能在低温条件下运送氧气，用化学和酶处理牛血红蛋白，已被作为一种获得多功能生物活性肽的一种方式，BHb生物活性肽有抗菌[1]、ACE抑制活性[2~3]，阿片样活性[4]，增强血管舒缓激肽作用[5]，镇痛活性[6]等功能。本文主要针对牛血红蛋白多肽的生物活性展开讨论，并分析其一级结构及其生物功能之间的关系，并将不同的生物活性肽在牛血红蛋白的α和β链上加以定位。BHb生物活性肽的研究进展将推动其在生物医药中的应用。

2 牛血红蛋白生物活性

2.1 抗菌活性：很多抗菌肽具有较长的氨基酸序列，可以形成α-螺旋线性结构、β-折叠环形结构、成环、延伸肽等，前两种在自然界中最为常见。据报道，这些抗菌肽结构与活性关系的研究表明抗菌活性要具有两个主要条件：一是带有正电荷[7]；二是两性分子构型的诱导形成[8]。其中的机制很明显是血红蛋白和一些细菌成分（如细菌多糖的酸性基团）直接结合引发反应[9]。此外，细胞穿透效率决定了肽的抗菌效率[10]。

20世纪70年代，在无脊椎动物到脊椎动物体内都有发现具有抗菌作用的活性肽。从那时起，在不同的物种中，如两栖类、昆虫和植物类，也都检测到很多抗菌肽的存在。Fogaca等[12]纯化了一个肽段，与从牛尾微小牛蜱内脏中得到的α33-61片段一致，并在1999年首次确定了牛血红蛋白的抗菌活性肽序列。他们提出，蜱利用宿主血红蛋白抵御外界微生物体。 根据Froidevauxa等[13]的报道，从消化性牛血红蛋白水解产物中分离出的肽的序列与α1-23片段的一致。此外，Naima等[14]已发现，从消化性牛血红蛋白水解产物中分离出的α107-136片段对不同的菌种都有抗菌活性。他们还曾在2008年分离鉴定出三十个抗菌肽，其中六个是位于牛血红蛋白β肽链上。它们分别是：β1- 13、β1- 30、β114- 145、β121- 145、β126- 145、β140- 145，其它24个肽段是位于α链上[15]。

牛血红蛋白在低程度水解过程中产生的多肽β126-145，对藤黄微球菌A270、英诺克李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌肠炎都表现出抗菌活性。在最低抑制浓度（MIC）时，细胞在四种细菌中孵育24小时后，细胞数都减少了至少97％。[15]。还有研究表明BHb α33-61片段的抗菌活性与BHb33-61a肽段具有相同的最低抑菌浓度，抑菌活性高，然而BHb α33-52和BHb α48-61的活性相对较低，抑菌活性高的肽的结构是由将含有β-折叠和螺旋单元的C末端与只有β-折叠的N末端连接[16]。相关具有抑菌活性的氨基酸序列如表1和表2。

2.2 ACE抑制活性:ACE是一个二肽基羧肽酶，广泛分布于哺乳动物的组织中，主要在血管内皮细胞中作为一种膜结合胞外酶。在肾素血管紧张素系统中（RAS），ACE通过血管紧张素Ⅰ转换为血管紧张素Ⅱ这一过程在血压调节方面起着重要作用，从而导致血管收缩伴随着血压升高和醛固酮的产生。此外，ACE会使抗高血压血管扩张缓激肽失活，后者是激肽释放酶-激肽系统中的一个九肽。由于已经得知血管紧张素Ⅱ具有升压活性，那么抑制ACE催化血管紧张素Ⅰ转换为血管紧张素Ⅱ可以成为高血压和充血性心力衰竭疾病治疗过程的重要方法途径[2，3]。

从牛血红蛋白中分离出的一些血衍吗啡对血管紧张素转换酶活性有抑制作用[18]。Zhao等[19]用反相高效液相色谱法从消化性牛血红蛋白水解产物中分离出VV-血衍吗啡-5和LVV-血衍吗啡-5。这两个多肽分别在其β链的31~38和32~38位置。证明了在无其它酶作用的情况下血衍吗啡对ACE活性的抑制作用，以及ACE在卡托普托存在与否时的FAPGG(2.5×10~5 M)水解酶活性。从结构上可以知道，LVV-血衍吗啡-5和VV-血衍吗啡-5的序列只有一处不同， LVV-血衍吗啡-5 N末端一个额外亮氨酸，就使得其抑制活性高出VV-血衍吗啡-5两倍。它表明，N端亮氨酸起着重要ACE抑制活性作用。

另外，这种现象也在LVV-血衍吗啡-7和VV-血衍吗啡-7之间中得到证明[20]。LVV-血衍吗啡-7和VV-血衍吗啡-7抑制ACE活性能力进行研究，并与AngIV进行比较分析。在含有0.05M Tris-HCl 的0.3M NaCl溶液中，50 μM的 FAPGG作为基底，在pH值为7.5条件下分光光度法检测出LVV-H7的ACE活性50% (IC50 )抑制浓度是1.7 μM，而VV-H7的是10.2μM，AngIV的是70μM。这表明，在体内，LVV-H7可看做ACE重要的抑制剂，LVV -H7将是在许多生理或病理情况下，补充或加强血管紧张素作用最经常用到的肽，这个也与生物活性完全一致[21]。这两种肽在体外能显着降低血管紧张素Ⅰ转换为血管紧张素Ⅱ。血衍吗啡在体外抑制ACE的活性已得到证实，特别是LVV-H7和AngIV。考虑到AngIV在RAS系统中水平较低，并且其生物半衰期很短，有人认为，这些药效比较好的ACE抑制肽（血管紧张素肽段和血衍吗啡）可以一起在RAS调节中发生作用。此外， ?EJKA等人也表示用无线电遥测计量检测到LVV-血衍吗啡-7可以显着降低自发性高血压大鼠的血压，并且在2001年首次证明了LVV-H7具有持久的降压活性[22]。

2.3 阿片类活性:阿片类活性肽是一种得到广泛研究的生物活性肽，它有阿片类活性共有的肽段X-Tyr-Phe、Tyr-X-X-Phe或Tyr-X-X-Ty。血衍吗啡由具有阿片受体亲和力的多肽组成，第一次在外源性消化道蛋白酶作用下从牛血红蛋白中分离出来，大量证据表明血衍吗啡可能是在生理或病理条件下在体内产生的[23,24]。Brantl等[4]首次分离Tyr-Pro-Trp-Thr和Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln阿片样活性肽，命名为血衍吗啡-4和血衍吗啡-5，分别对应于牛血红蛋白β链34-37和34-38肽段，其他三个肽：LVV-血衍吗啡-7（β31-40），VV-血衍吗啡-7（β32-40）和VV-血衍吗啡 -4 （β32- 37）及两个以上肽段： LVV-血衍吗啡-5（β31-38）和VV-血衍吗啡-5（β32-38）。具有阿片活性的VV-hemoglobin-5 和LVV-hemoglobin-5已在1997年开发研究确定下来[19]。在血衍吗啡-4的基础上，还得到了血衍吗啡-5、血衍吗啡-6、血衍吗啡-7、血衍吗啡-8。除此之外，还合成了一些肽段，比如LVV-haemorphin-7、VV-haemorphin-7、Val-Val-血衍吗啡-4等,详细见表3。

LVV-H7，是从牛血红蛋白得到的研究最为广泛的肽，它最初是作为一种产生于血红蛋白消化蛋白酶的阿片肽，并可以通过二抗酶联免疫吸附试验定量[25]。此外，LVV-H7是一种内源性配体，是血管紧张素IV (Ang IV)在大脑的结合位点。Ang IV是Ang II活性片段，其中包括6个C末端氨基酸。Isabelle等人表明，N端有缬氨酸或亮氨酸，C端有苯丙氨酸的血衍吗啡是AngIV在AT4受体和APN的催化部位有力竞争者。因此，Ang IV和血衍吗啡共享相同的受体和降解途径，表明血衍吗啡有可能是在肾脏作为内源性Ang IV类似物，像在大脑中一样。此外，具有阿片类药物的活性的LVV-H5，几乎可由LVV-H7形成，产量超过95％的。此外，LVV-H7肾细胞质新陈代谢的主要产物VVH7、H7和LVVH6，且都表现出氨基肽酶和羧基肽酶活性[26]。

2.4 其他生物活性：研究者还从牛血红蛋白中分离出了具有缓激肽增效肽活性的α129-134、具有镇痛作用的VII-1（α 135-141）、VI-3（α137-141）、VII-2（β 138-141）[33]、kyotorphin(α 140-141)和neokyotorphin (α 137-141)[34]，具有细菌生长刺激作用的（β138-141）[35]，为进一步研究牛血红蛋白生物活性肽提供了基础。

3 结论与展望

本文综述了牛血红蛋白活性肽生物学功能和其一级结构关系的研究，不同的肽段的生物活性不同，其中抗菌活性，抑制血管紧张素转化酶（ACEI），阿片样活性已经得到广泛的研究，其他诸如缓激肽增强作用、镇痛、促进细菌生长刺激作用也在被人们进一步研究。它们的结构和生物活性的研究将对药物研发及相关化学药物、天然药物和生物医药的设计有很大的推动作用。

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作者单位：362021 华侨大学分子药物研究所1

362021 教育部分子药物工程研究中心2