杂色曲霉中的一个具有细胞毒活性的新异香豆素

[摘要]采用硅胶、凝胶、MCI-GEL树脂及PR-HPLC等多种现代色谱分离技术对杂色曲霉的发酵产物进行了化学成分研究，从中分离鉴定了1个新的和5个已知的异香豆素类化合物。它们的化学结构通过多种波谱数据分析，包括一维和二维核磁共振数据得以确定。对化合物1进行了5种人类癌细胞株的细胞毒活性筛选。结果表明化合物1对NB4，SHSY5Y，MCF7细胞株有弱抑制活性，其ICso分别为6.8，4.3，8.8 μmol・L-1。

[关键词]异香豆素；杂色曲霉；细胞毒活性

近年来，从传统药用植物的内生真菌次生代谢产物中寻找活性物质，已成为植物内生真菌研究的热点，滇重楼的一些内生真菌在体外培养的条件下可以产生具有抗癌活性的甾体皂苷。从不同来源的杂色曲霉发酵产物中分离得到的化学成分具有不同活性，孙静贤等研究发现，滇重楼的杂色曲霉次生代谢产物有抑菌活性，Capo课题组从海洋沉淀物分离到的杂色曲霉中发现了1个有抗结核杆菌活性二酮哌嗪二聚体brevianamideS；本课题组的周敏等从滇重楼的杂色曲霉中，分离得到了2类具有显著抗烟草花叶病毒活性的新骨架吲哚生物aspergillines。综上，杂色曲霉次生代谢产物在发掘活性好的新化合物方面具有潜在研究价值基于前人的研究，本实验进一步对编号（Genbank accession no.KJ801852）的杂色曲霉次生代谢产物进行了化学成分研究，杂色曲霉Asperzillus versicolor是从采自云南大理的滇重楼Paris polyphylla Smith var.yunnanesis（Franch.）Hand.-Mazz根茎中分离所得。从中分离得到1个新异香豆素类化合物，5个已知异香豆素类化合物，结构见图1。并用MTT法测定了化合物1对NB4，A549，SHSY5Y，PC3，MCF7 5种人癌细胞株的细胞毒活性，结果表明化合物1对NB4，SHSY5Y，MCF7具有弱体外细胞毒抑制活性。

1材料

1.1仪器与设备UV-2401 A紫外光谱仪（日本岛津公司）：Bio-Rad FTS-185傅里叶变换红外光谱仪（美国伯乐BIO-RAD公司公司）；DRX-500核磁共振仪（瑞士布鲁克公司）；半制备HPLC分析仪器为岛津LC-8A型高效液相色谱仪，色谱柱为安捷伦公司zorbax PrepHT GF（21.2 mm×250mm）。

1.2材料与试剂 拌样硅胶80～100目，色谱硅胶200～300目，GF254（100 mm×100 mm）硅胶板，均为青岛海洋化工厂生产：反相填充材料Rp-18（40～63 um），Merk公司生产：MCI填充材料为MCI-gelCHP-20P（75～150μm），日本三菱公司生产；薄层色谱显色剂为5%H2SO4/乙醇溶液；三氯甲烷、甲醇、乙酸乙酯、石油醚为工业纯；色谱纯乙腈为天津市瑞金特化学品有限公司生产；超纯水为娃哈哈饮用纯净水。

1.3菌种来源与鉴定 菌株由云南民族大学杜刚教授实验室2012年采自云南大理的滇重楼P.polyphylla var.yunnanensis根茎中分离得到，鉴定为滇重楼内生真菌杂色曲霉A.versicolor，菌株Genbank accession编号为KJ801852，存放于杜刚教授实验室。

2提取与分离

2.1菌株固体放大发酵 液体培养基：PDA培养基。固体培养基母瓶发酵方法：在装有100 mL PDA培养基（灭菌后）的250 mL锥形瓶中接种杂色曲霉菌种，共接种20瓶，以28℃、转速180 r・min-1培养5d。

固体培养基：大米、珍珠岩、蒸馏水。具体方法：每个500 mL培养瓶中装入搅拌均匀的固体培养基（100 g大米、120 mL蒸馏水、适量珍珠岩），共装200瓶，进行高压灭菌。灭菌后，每瓶固体培养基接种约5.0 mL菌种，搅拌均匀，在培养室中25℃培养45d。

2.2菌株固体发酵产物的提取 固体发酵产物合并于50 L塑料桶中，用70%工业甲醇浸泡1周，超声4次，30 min/次，提取得到滤液。以上步骤重复4次，所得全部提取液合并，用旋转蒸发仪浓缩得到浸膏560 g。

2.3菌株次生代谢产物的分离将上述浸膏560 g溶于甲醇后，用200～300目的硅胶拌样后装填大型硅胶柱，进行柱色谱分离，用不同梯度的氯仿-丙酮体系作为流动相，分为6个极性段（1：0，20：1，9：1，8：2，7：3，6：4），依次得到A，B，C，D，E，F 6个组分。

流分D（12.5 g）用硅胶柱色谱法进一步分离，以石油醚-乙酸乙酯体系（9：1，8：2，7：3，6：4，1：1）梯度洗脱，得到亚组分D1～D5。亚组分D2（1.2 g）再进一步用RP-18柱分离，以甲醇_才（体系（20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇）进行梯度洗脱，得到组分D2-1～D2-4。组分D2-4（105 mg）经过半制备型HPLC（75%甲醇-水，流速3.0 mL・min-1）纯化，依次得到化合物1（7.2 mg），2（8.6 mg），3（14.2 mg），4（24.7 mg），5（3.2 mg），6（5.3 mg）。

3结构鉴定