T辅助淋巴细胞的功能变化在急性肺损伤中的意义研究

【摘要】 目的：探讨T辅助淋巴细胞的功能变化在急性肺损伤中的意义。方法：选取100只小鼠作为研究对象，采用随机数字表法将其分成观察组和对照组，每组50只。观察组小鼠注射适量脂多糖制作急性肺损伤模型，通过酶联免疫吸附测定小鼠细胞清液内的干扰素及白细胞介素含量，采用逆转录-PCR测定方法对小鼠IFN-γ基因表达情况进行检测，观察比较两组测定结果。结果：观察组小鼠上清液中IFN-γ的含量明显低于对照组，IL-4含量明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义（P

【关键词】 T辅助淋巴细胞； 功能变化； 急性肺损伤； 意义研究

【Abstract】 Objective：To investigate the significance of functional changes of T helper lymphocyte in acute lung injury.Method：100 mice were selected and randomly divided into the observation group and the control group，each group had 50 mice.Mice in the observation group were injected with proper amount of LPS and made models of acute lung injury.The contents of interferon and interleukin in the cell supernatants of mice were measured by enzyme linked immunosorbent assay.The expression situation of IFN-γ gene in the mice’s spleen cells was measured by reverse transcriptase-PCR determination method.The measurement results were compared between the two groups.Result：The content of IFN-γ in the observation group was lower than that in the control group，the content of IL-4 in the observation group was higher than that in the control group，the differences were all statistically significant（P

【Key words】 T helper lymphocyte； Functional change； Acute lung injury； Significance research

First-author’s address：The First People’s Hospital of Guangzhou City，Guangzhou 510180，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.25.005

目前认为，促炎与抗炎反应失衡为诱导急性肺损伤发生的根本原因，但目前对促炎与抗炎反应失衡准确评估有较大难度。大量研究表明，T辅助淋巴细胞可反映机体炎症反应的免疫功能状态，其功能变化在急性肺损中的作用较大[1]。为了探讨T辅助淋巴细胞的功能变化在急性肺损伤中的意义，本文选取100只小鼠作为研究对象进行分析，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 实验小鼠均为野生鼷鼠的变种，来源于野生的小家鼠，选取100只小鼠作为研究对象。采用随机数字表法将其分成观察组和对照组，每组50只，雌雄各半，体重20～24 g。两组小鼠的一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 小鼠处理 首先为观察组小鼠进行适量脂多糖（LPS）的注射，其注射的部位主要在小鼠腹腔处，7.5 h之后再为小鼠注射适量的甲酰基-苯丙氨酸，然后进行急性肺损伤小鼠基本模型的制作，等到大约3.5 h之后将小鼠处死；对照组小鼠则进行适量生理盐水的简单注射，注射的量和观察组小鼠药物注射量相同。

1.2.2 细胞培养 在对小鼠进行有效处理之后，按照相关要求进行小鼠脾细胞的正常分离，适量增添细胞培养液，利用显微镜观察小鼠脾细胞的数量，然后对小鼠脾细胞进行稀释处理，最终使其量控制在10×106个左右，加入适量的刀豆素，使其浓度控制在1.1 μg/mL左右，温室温度下及4.5%浓度的二氧化碳的环境下进行细胞培养，细胞培养的时间在70 h左右，培养结束之后，留取细胞上清液，检测上清液中的IFN-γ浓度及IL-4浓度，最后提取脾细胞中的RNA。

1.2.3 浓度测定 在检测细胞当中的相关因子浓度时，需要用到IFN-γ酶的专门吸附盒和IL-4酶的专门吸附盒，按照吸附盒上面的具体要求进行细胞测定，利用酶标仪对波长500 nm的位置进行密度检测，按照标准曲线的变化规律，最终确定小鼠细胞当中的具体因子浓度。

1.2.4 基因表达数量计算 利用PCR的标准测定试剂盒，进行小鼠脾细胞当中的基因转录，使其最终合成cDNA，然后进行PCR的有效扩增。对引物序列进行正常排序，主要包括IFN-γ、IL-4以及β-actin的序列引物，它们分别有各自的上游引物和下游引物。经过对引物图像的观察和分析进行产物测量，对三大序列产物进行正常扫描，确定出具体的光密度数值，最后进行三大序列引物光密度数值的相互对比，从而测得基因表达。

1.2.5 损伤指标检测 首先进行肺组织含水量的正常检测，在处死小鼠以后，把小鼠的右肺进行有效割除，进行表面水清除之后进行肺组织称重，称重之后放到专门烘箱当中进行有效烘干后称重；然后进行漏出量的具体检测，在小鼠腹腔当中进行药物注射，处死小鼠之后利用专用针进行小鼠右心室的有效穿刺，利用适当浓度的生理盐水进行小鼠肺部的清洗，使其完全干净，切除小鼠的肺部相关组织，对肺门组织进行正常称重，进行小鼠肺组织的孵育，孵育的时候要添加适量的甲酰胺，收集其浸出的液体，进行液体吸光值的具体有效计算。对照组小鼠确定伊文思蓝的具体浓度值；最后进行小鼠肺组织的有效观察，进行肺下叶的正常染色，观察其病理变化情况，利用相关分析软件确定出细胞PMN的平均值。

1.3 观察项目和指标 （1）小鼠上清液中IFN-γ的含量及IL-4含量；（2）脾细胞中IFN-γ的基因表达能力[2]。

1.4 统计学处理 所得数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验，以P

2 结果

观察组小鼠上清液中IFN-γ的含量明显低于对照组，IL-4含量明显高于对照组，两组比较差异有统计学意义（P

3 讨论

急性肺损伤是一种各种致病因素引发的广泛肺泡毛细血管损伤，以致炎因子释放、中性粒细胞浸润、广泛肺泡毛细血管损伤为特征，临床以难以纠正的低氧血症及进行性呼吸困难为主要表现，急性严重肺损伤，在临床被定义为急性呼吸窘迫综合征[3]。如何对肺损伤过程中肺泡受损毛细血管保护并修复，是肺保护的重点。ALI的发生发展，由机体过度炎症反应参与介导[4]。危重病医学会在2001年将机体过度炎症反应定义为全身炎症反应综合征，其后果为破坏机体自身组织。机体内源性抗炎症反应伴随炎症反应的发生，呈增强趋势[5]。Bone等[6]将此种抗炎症反应按抗炎症反应综合征概括，其引发的后果是脓毒症及免疫功能低下，故不管哪方占优势，ALI病发中，促炎及抗炎反应失衡均为本质原因。故针对检测的促炎、抗炎反应失衡的程度和方向，应用不同的措施干预，使双方动态平衡恢复，是对ALI防治的关键。但对促炎、抗炎双方平衡的相关性评价，目前临床尚无有效评估指标。有研究显示，Th细胞，可反映双方平衡关系，Th1细胞以对促炎细胞因子分泌为特征，与促炎反应有密切相关性；Th2细胞以对抗炎细胞因子分泌为特征，与抗炎反应有密切相关性[7-9]。IFN-γ、IL-4为特征性细胞因子，分别由Th1、Th2细胞分泌，二者平衡，可反映促炎和抗炎的平衡情况。

有研究示，取LPS、FNLP经腹腔注射后，肺湿重与干重比、肺伊文斯蓝浸出量、肺病理改变均提示成功建立ALI模型[10]。对脾细胞中IL-4、IFN-γ变化进行观察，结果相较对照组，BLAB/C小鼠在ALI时，脾细胞中IFN-γ呈近60%的下降，而检测IL-4，呈4倍多的升高。此与蒋雄斌等[10]报道一致，但IL-4升高更为明显。

IFN-γ、IL-4是反映Th1及Th2平衡变化的典型细胞因子，此种变化表明，在ALI发生时，Th1漂移至Th2。目前研究显示，Th1飘移至Th2，与下列因素可能相关。（1）LPS结合单核巨噬细胞表面CD14受体，对TNFα、IL-1等炎症细胞因子释放，同时伴随大量抑制介质前列腺素E2的释放，经PGF2依赖性通道，促使Th细胞向Th2表型明确转化。PGE2可对Th1合成IFN-γ、IL-2明显抑制，却对Th2生成IL-4不影响[11]。（2）与炎症介质IL-6、IL-1、TNF-α的释放伴发，糖皮质激素有增加表现，糖皮质激素可对Th1细胞核转录抑制因子合成增加产生刺激，此因子与核因子结合，促使复合物形成，从而对炎症细胞因子的基因转录阻止[12]。此外，糖皮质激素，可影响炎症细胞因子相关基因转录。

对脾细胞中的IFN-γmRNA表达进一步观察得出，ALI时IFN-γmRNA表达下降明显，IL-4m RNA表达量显著升高。提示ALI时，可在mRNA水平上使促炎细胞因子IFN-γ的表达抑制，抗炎细胞因子IL-4的表达增加，从而引发促炎、抗炎失衡。

Th1向Th2飘移，表明抗炎症反应在ALI发生时，呈增强趋势，而抗炎症反应的增强，诱导机体细胞免疫功能出现低下。故可通过对Th1、Th2平衡变化检测，选择适当的时机，针对免疫功能低下，采取有效的免疫调节措施，使促炎、抗炎平衡恢复，对ALI进行防治。促炎与抗炎反应失衡，为诱导急性肺损伤发生的本质原因，对促炎与抗炎反应失衡准确评估有较大难度[13]。T辅助淋巴细胞可反映机体炎症反应的免疫功能状态。

在受到严重的创伤之后，伤口是容易感染的，而在感染之后，伤口处容易出现各种病毒和细菌，会严重损害人们的身体健康。相关研究结果证明，急性肺损伤与体内炎症反应不平衡相关，会导致机体促炎、抗炎反应不平衡[14]。机体内各类脾细胞当中，存在很多促炎细胞和抗炎细胞，比如干扰素和白介素等，只有保证这两种因子平衡，才能保证两种细胞平衡[15]。当发生急性肺损伤，机体炎症反应规律是不明确的，各种细胞的反应情况也是不明确的，本文主要通过对急性肺损伤小鼠的功能试验研究，反应急性肺损伤机体炎症反应情况。

相关研究结果表明，在急性肺损伤研究当中，观察机体炎症反应是比较重要的，因为在肺损伤的过程中，会产生伤口感染从而引起伤口炎症出现[16]。因此，通过肺损伤相关部位抗炎反应及能力的检测和观察，就可以判断急性肺损伤病情。本文主要通过小鼠淋巴细胞试验，对小鼠急性肺损伤的相关平衡因子和基因表达功能进行检测，最终发现，机体抗炎反应在急性肺损伤中的作用非常大，而T辅助淋巴细胞对小鼠体内这种抗炎反应的调节和控制作用也比较大，在急性肺损伤疾病临床研究中的意义比较大。急性肺损伤机体抗炎反应主要表现为单核细胞的有效受体结合、抗炎因子的生成和细胞免疫因子的生成、IFN-γ和IL-4两大因子的有效合成和转化、IL-10因子的生成和增加、糖皮质激素的不断增加及脾细胞因子的异常转录等[17]。经过对小鼠体内T辅助淋巴细胞功能变化的有效观察可以判断急性肺损伤小鼠的病理学变化情况，急性肺损伤小鼠脾细胞mRNA表达能力比正常小鼠弱很多，证明抗炎反应是导致急性肺损伤的主要原因。

本研究结果表明观察组小鼠上清液当中IFN-γ的含量明显比对照组低，IL-4含量却比对照组高，且经过逆转录测定结果显示，观察组小鼠体内脾细胞IFN-γ基因表达能力明显比对照组低，以上比较差异均有统计学意义（P

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（收稿日期：2015-02-13） （本文编辑：王利）