酿酒酵母高产乙醇工程菌选育研究进展

摘要：能源危机背景下，近年来由于酿酒酵母在生物质能源中的潜力而被广泛关注，但是目前酿酒酵母在高温、产物抑制耐性等方面仍然有诸多不足之处，这无疑提高了生产的工业成本。人们在解决生物质能源发酵过程中需要获取更高产的菌株。文章梳理了近年来选育酿酒酵母高产乙醇菌种的研究进展，以期为广大研究者提供研究思路。

关键词：酿酒酵母;生物质能源;工程菌种;育种;生物质能源 文献标识码：A

中图分类号：TS261 文章编号：1009-2374（2016）04-0067-02 DOI：10.13535/ki.11-4406/n.2016.04.034

酿酒酵母被广泛应用于食品行业及酿酒行业，人们一直以来都在利用各种技术对其进行选育和改良，诸如传统诱变、自然选育等，研究人员更是试图寻找优良的菌株应用于食品等行业的生产。近年来，基因技术的快速发展使人们在分子层面上对酿酒酵母更加了解，酿酒酵母作为经典模式生物其基因序列已于1996年完成。此外，当今社会能源资源大量消耗，环境问题日益突出，寻找可再生新能源已是人们摆脱能源危机的重要途径，乙醇作为生物质能源代替化石燃料已成为人们的普遍共识。尽管目前有很多种生产乙醇的方法，使用的工程菌种也多种多样，但是酿酒酵母产生乙醇的方式仍然是最有效的途径。因此，利用现在的基因技术对产乙醇的酿酒酵母进行改造，力求提高乙醇的产量，不仅对食品酿酒行业产生巨大的影响，同时对缓解能源危机也产生深远的影响。所以近年来在酵母方面的研究大多着力于改良提高酿酒酵母的乙醇产量。本文梳理了近年来酿酒酵母的研究进展，以期为广大研究者提供研究思路。

1 酿酒酵母的选育

1.1 酿酒酵母的常规育种

一直以来，人们利用各种方法选育优良菌株，常规育种技术包括自然选育和诱变育种，自然选育是外界环境对菌种的选择，也是生物生存的法则，利用生物内部诸如半保留复制、DNA修复等机制产生的不定向变异，经定向筛选保存留下有利的变异，从而获得有利的优良工程菌种，常规育种是目前人们获得优良菌种的简单有效的方法。

诱变育种是利用外在的条件诸如物理的、化学的手段对菌种施加外源影响，增加突变频率再来选择优良菌种的方法。我们经常使用的紫外诱变来对酿酒酵母进行筛选。李艾，李云凯等以实验室保存的酿酒酵母菌种为原始菌株利用紫外诱变，获得了一株高温下仍高产乙醇的菌株。另外，利用诱变育种和基因重拍技术相结合即紫外诱变筛选出耐高温且产量高的菌株，再进行杂交获得产量优异的菌株。

1.2 原生质体融合

原生质体融合是人们利用两个不同的原生质体在克服细胞壁的天然障碍后进行融合，由于其集中了两核的遗传物质，能够获得更多的遗传信息，产生更大的遗传优势，同时也克服远源不能杂交的障碍。挑选性能较好的酿酒酵母菌株，利用原生质体融合技术，可以为我们提供性能优异的高产酿酒酵母菌株。Choi等早已利用此技术将贝酵母（S.bayanus KCMM12633）原生质体和酿酒酵母（S.cerevisiae CHY1011）原生质体进行融合获得的CHFY0321菌株具有较高的发酵性能，乙醇产量得到较大的提高。原生质体融合为我们选育酿酒酵母提供了一条新的途径。

2 基因工程选育酿酒酵母

基因工程应用广泛。基因工程即基因拼接技术，是现代一门新型分子生物技术，它利用分子遗传学理论，将体外的外源基因经质粒构建后导入细胞内，获得转基因细胞，由于基因在体外构建，可以更好地按自己的目的去设计我们所需的产品。近年酵母的分子生物研究进展揭示了在酿酒酵母的GC含量较高的地方发生基因重组的频率较高其中在16条染色体中较短的染色体相对整个基因组水平其重组频率较高。这为我们对酿酒酵母的改良提供了研究方向，利用这些容易发生重组的基因区可以让我们筛选到较好的产乙醇菌株。徐国强、吴满珍等利用功能基因组学的方法研究了酿酒酵母的116个单基因缺失菌株发酵试验，其结果表明不同的缺失基因，乙醇产率会有较大的区别，尽管没有进行大规模的试验，但这为研究人员利用基因工程技术对酵母菌株进行改良提供了基础。例如，与酿酒酵母乙醇产率相关基因hsf1过量表达后，乙醇的产量大大增加，其产物耐性增强，并且产物的高温耐性也增加。如果敲除酿酒酵母的gpd1和gpd2基因（这两个基因控制碳流方向）反而可以获得更高的乙醇产量。我们对酿酒酵母的产物耐性的相关基因已经有所了解，对于与酿酒酵母产物耐性有关的诸多基因，如果我们单从考虑某一个基因或者某一类基因都不能获得更好的发酵用菌株。现有研究已经通过基因技术对一种酵母的基因组进行改良，并且取得了较为理想的效果。如Wei等对克鲁斯假丝酵母的多个基因进行改造，所获得的菌株在各个方面的性能都显示出了比野生型菌株更加优异。

除此之外，利用基因工程技术对酿酒酵母进行定向改良已是我们的研究热点，高丽丽等就通过基因敲除和反义RNA技术在酿酒酵母细胞内影响ERG7基因。再者对于酵母来说，其代谢过程也是由诸多相关基因构成的，有研究就对代谢过程进行了定向改造，通过对酿酒酵母代谢过程的转录因子SPT3进行随机突变，然后筛选到了耐乙醇性能的菌株，这项研究为我们利用基因工程改造酿酒酵母又提供了一个靶基因。

酿酒酵母发酵过程中有乙酸和甘油两种主要副产物，曹罗元等人通过构建反义表达载体抑制酿酒酵母Y01工程菌中甘油脱氢酶关键基因GPD1转录，同时删除了酿酒酵母DY1工程菌中的乙醛脱氢酶ALD4基因，抑制了酵母发酵中甘油的产量，进而获得了乙醇产量更高的新型工程菌株――DRY01，其相对原种Y01甘油产量降低了19%，乙醇产量提高了14%。这意味着通过改变酿酒酵母的代谢方向可以更好地利用甘蔗等高糖类植物更高效的生产乙醇。此外影响酿酒酵母大规模生产乙醇的还存在经济问题，目前酿酒酵母生产乙醇主要依赖谷物和甘蔗等高糖类植物，这些植物本身就是粮食或经济作物，用来生产乙醇未免过于浪费资源，而且成本很高，这与人们追求廉价、清洁可再生能源的目的相抵触。野生型酿酒酵母只能有效利用葡萄藤发酵乙醇，但是不能利用木糖。理想情况下应该使用大量废弃的农产品的副产物，例如秸秆、稻壳、叶片等。限制大规模使用此类副产物的主要问题是需要先经稀酸水解木质纤维素才能被酿酒酵母有效分解，这既增加成本又破坏了环境。为了解决这个问题，需要为酿酒酵母增加木糖代谢途径。陆亮、涂振东等人通过将导入5种外源的木糖代谢基因（平滑假丝酵母中的木酮糖激酶基因xks1、热带假丝酵母中的木糖醇脱氢酶基因xyl2、树干毕赤酵母中的木酮糖激酶基因xks1、酿酒酵母内源的转醛酶基因tal和转酮酶基因tkl1做成转基因工程菌），随后在木糖/葡萄糖比例为1∶5的碳源培养基中，乙醇得率为74.85%，有效糖利用率为96.78%，较为有效地利用了木糖。此外区健发、朱明军等人通过RACE获得了葡萄牙假丝酵母、管囊酵母和红法夫酵母中的新型木糖还原酶（XR）、木糖醇脱氢酶（XDH）基因，并联合嗜热厌氧杆菌的木糖异构酶（XI-PB8），将其重组到酿酒酵母中，获得同时具有三条外源木糖代谢途径的重组工程菌，并证明了其具有木糖代谢能力。

3 结语

在大力开发生物质能源的背景下，我们需要尽可能地提高生产乙醇的效率，这其中涉及改造酿酒酵母的耐性、产物抑制效应、更广泛的发酵底物、提高碳源利用效率等。目前虽有一些生物能源公司发酵获得乙醇或甲醇，但由于其发酵是使用大量粮食作物作为底物，在社会上饱受抨击，所以最好的方式是将能源生产和环境保护相结合，尽量利用农业生产中的废弃物如秸秆、叶片、叶柄、木屑等木质纤维素发酵，但是野生的酿酒酵母不能代谢纤维素，所以近期的研究热点是通过基因工程的方式将外源的木糖代谢相关基因导入酿酒酵母形成转基因工程菌种。目前此类研究发展很快，研究人员已通过各种途径获得了一些能够利用木糖的工程菌，虽然还存在一些产量低、性能不稳定等生产工艺问题，尚不能投入实际使用，但是通过基因工程的方式将外源的木糖代谢相关基因导入酿酒酵母，形成转基因工程菌种，进而有效利用纤维素资源的方式，是解决生物质能源的一种有效途径。

参考文献

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