柴芩软胶囊质量标准研究

[摘要] 目的 制定新药柴芩软胶囊质量控制方法。 方法 采用TLC法对方中的柴胡、葛根、山豆根和升麻进行定性鉴别；用HPLC测定黄芩中黄芩苷的含量。色谱条件：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm；5 μm）色谱柱；流动相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：20℃。 结果 柴胡、山豆根、葛根、升麻的供试品与对照药材及对照品色谱在相应的位置上均有相同颜色的斑点，阴性样品溶液无干扰，专属性强；黄芩苷在0.28～1.40 μg范围内具有良好的线性关系（r = 0.9999），平均回收率为99.74%，RSD为0.85%。 结论 该法能有效地控制产品质量。

[关键词] 柴芩软胶囊；TLC；黄芩苷；HPLC；含量测定

[中图分类号] R461 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）09（c）-0100-04

柴芩软胶囊系原国家食品药品监督管理局2000年批准上市的药品。本制剂处方原于吉林省中医院的院内制剂，本处方由柴胡、黄芩、葛根、山豆根、升麻等组成，具有舒肌解表、辛凉泄热、清透表里等功效。为控制产品质量，本文参考有关文献[1-13]对处方中的柴胡、葛根、山豆根及升麻四位药进行了定性鉴别，对黄芩中的主要有效成分黄芩苷进行含量测定，从而为全面控制柴芩软胶囊产品质量提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-10ATVP液相色谱仪；Class-vp工作站，AE204十万分之一电子天平；KQ-700DE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

柴胡对照药材（批号：120992-200504）、山豆根对照药材（批号：120976-200503）、葛根对照药材（批号：121551-200601）；苦参碱、氧化苦参碱对照品（批号：110805-200508、110780-200506）、葛根素对照品（批号：0752-200209）、阿魏酸对照品（批号：0773-9708）、黄芩苷对照品（批号：110715-200504）；均购自中国药品生物制品检定所；柴芩软胶囊（批号：080301、080302、080303）颈复康药业集团有限公司生产；硅胶G板（批号20080323）青岛谱科分离材料有限公司；甲醇：（色谱纯，赛默飞世科技有限公司）；水：重蒸水；其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 鉴别

2.1.1 柴胡

取本品5粒，倾出内容物，加1 g硅藻土，研磨混匀，加入25 mL的甲醇超声（50 kHz，250 W）30 min后，放冷，溶液过滤，取滤液在水浴锅上蒸干，残渣加入20 mL水使溶解。水相用乙醚萃取2次，每次20 mL，合并水相后用水饱和正丁醇萃取2次，每次20 mL，弃去水相，正丁醇相合并后用20、20 mL氨试液洗涤2次，弃取氨液，合并正丁醇相后在水浴上蒸干，残渣用甲醇1 mL使溶解，得供试品溶液。另取0.5 g柴胡对照药材，研细，加30 mL水在80℃水浴温浸30 min后加热回流提取1 h，放冷，滤过，滤液加入水饱和正丁醇萃取2次，每次20 mL，取正丁醇相合并，加入等体积的氨试液，摇匀，放置使分层，分取正丁醇层，在水浴80℃下蒸干，加1 mL甲醇溶解残渣得对照药材溶液。取和供试品等量不含柴胡药材的阴性样品，依供试品溶液的操作方法制得阴性样品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，分别吸取5 μL的上述溶液，点样于同一硅胶G板，取水-甲醇-三氯甲烷（2∶7∶13）置分液漏斗中混匀，在10℃环境下放置30 min，待分层后取下层溶液为展开剂，在层析缸中展开，取出后晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛40%硫酸混合溶液，用热风吹干后分别在日光和紫外灯（365 nm）下观察。在供试品色谱中，与对照药材色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的粉色斑点，紫外灯下显相同颜色的荧光斑点。阴性样品溶液的色谱中在相应位置无斑点出现。见图1、2。

2.1.2 山豆根

取5粒本品内容物，加入2 g硅藻土，研磨混合均匀，加20 mL甲醇并超声（50 kHz，250 W）提取30 min，放冷后过滤，取滤液蒸干，加3%盐酸溶液20 mL溶解残渣，滤过，滤液用氨水调pH值至10～11，分别用20、20 mL三氯甲烷萃取2次，合并后的三氯甲烷液蒸干，加2 mL甲醇溶解残渣，即得供试品溶液。取等量不含山豆根的阴性样品及2 g山豆根对照药材，同法制成对照药材及阴性的溶液。取苦参碱和氧化苦参碱对照品分别加甲醇配成浓度为1 mg/mL的对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，分别吸取5 μL上述溶液，点样于同一硅胶G板上，以氨水-甲醇-三氯甲烷（0.1∶1∶4）为展开剂，在层析缸中展开，取出并晾干，喷以稀碘化铋钾试液并用热风吹至斑点清晰。供试品色谱中，在与对照药材和对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点。阴性样品溶液的色谱中在相应位置无斑点。见图3。

2.1.3 葛根

取5粒本品的内容物，加入硅藻土2 g，研磨混合均匀，加20 mL甲醇并超声提取30 min，放冷后过滤，取滤液蒸干，加15 mL水溶解残渣，加水饱和正丁醇20 mL萃取，分取正丁醇相并置水浴锅上蒸干，加2 mL甲醇溶解残渣，即得供试品溶液。取2 g葛根对照药材粉末和缺葛根阴性样品，同法制成对照药材和阴性样品的溶液。再取葛根素对照品加甲醇制成浓度为1 mg/mL的对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，分别吸取供试品溶液、对照药材溶液及对照品溶液各5 μL，点样于同一硅胶G板上，以三氯甲烷-甲醇-水（7.8∶3.5∶1.0）混匀后的下层溶液为展开剂展开，取出并晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。在供试品色谱中与对照药材及对照品色谱相应的位置显现相同颜色的荧光斑点。阴性样品溶液的色谱中在相应位置无斑点。见图4。

2.1.4 升麻

取5粒本品的内容物，加入硅藻土2 g，研磨混合均匀，加50 mL 1%碳酸氢钠溶液超声提取10 min，滤过，滤液用稀盐酸调pH值至2～3，加乙醚萃取3次，每次分别为20、15、15 mL，合并乙醚相并置水浴锅上挥干，加1 mL甲醇溶解残渣得供试品溶液。另分别取2 g升麻对照药材粉末和缺升麻阴性样品，同法制成对照药材和阴性样品的溶液。取阿魏酸对照品加甲醇制成浓度为1 mg/mL的对照品溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010年版一部附录Ⅵ B）试验，分别吸取供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液各5 μL，点样于同一硅胶G板上，以苯-醋酸乙酯-甲酸（4∶1∶0.1）为展开剂展开，取出并晾干，置于紫外灯（365 nm）下检视。在供试品色谱中与对照药材及对照品色谱相应的位置显现相同颜色的荧光斑点。阴性样品溶液的色谱中在相应位置无斑点。见图5。

2.2 含量测定

2.2.1 色谱条件

Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm；5 μm）色谱柱（迪马公司）；流动相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：室温。

2.2.2 溶液制备

2.2.2.1对照品溶液的制备 精密称取在60℃减压干燥4 h黄芩苷对照品适量，加甲醇适量，置热水浴中振摇，使溶解，放冷至室温，用甲醇稀释到刻度，摇匀，制成0.07 mg/mL的黄芩苷对照品溶液。

2.2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取混匀后的内容物2.0 g，加70%乙醇60 mL回流提取3 h，放冷后滤过，取滤液置于100 mL容量瓶中，以70%乙醇定容，摇匀，精密量取1 mL上述溶液置于10 mL容量量瓶中并以甲醇定容，摇匀即得。

2.2.2.3 阴性溶液 按处方比例制成缺黄芩的软胶囊样品，按“2.2.2.2”项下方法制得阴性样品溶液。

2.2.3 专属性试验

取对照品溶液10 μL、供试品溶液及阴性样品溶液各5 μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图6。黄芩苷色谱峰与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，阴性色谱图无干扰峰。理论塔板数按黄芩苷计算不低于3000。

2.2.4 线性关系的考查

分别精密吸取对照品溶液4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 μL，注入液相色谱仪，以黄芩苷峰面积积分值（Y）对黄芩苷的浓度（X）作标准曲线，计算黄芩苷的回归方程：Y=-8468.4+455 598.57X，r = 0.9999，结果表明黄芩苷在0.28～1.40 μg范围内呈良好的线性关系。

2.2.5 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液5 μL，每隔2小时进样一次，平均峰面积195 680.5，RSD=1.62%。 结果供试品溶液色谱峰面积在8 h内基本无变化，说明供试品溶液在8 h内稳定。

2.2.6 精密度试验

精密吸取同一批号的供试品溶液（批号：080301），重复进样5次，平均峰面积为202 024，RSD=1.32%。结果表明本法精密度高。

2.2.7 重现性试验

准确称取同一批号（批号：080301）样品的内容物，依“2.2.2.2”项下处理样品并测定黄芩苷含量，黄芩苷平均含量为38.52 mg/粒，RSD=1.17%。结果表明本法重现性好。

2.2.8 回收率试验

精密称取取已知黄芩苷含量的样品9份（批号：080301，含量38.52 mg/粒，平均粒重：0.4809 g），分别精密加入一定量的黄芩苷对照品，依“2.2.2.2”项下处理样品并测定含量，计算回收率，结果见表1。

2.2.9 样品含量测定

取本品3批（批号：080301，080302，080303）每批准确称取3份，按“2.2.2.2”项下处理样品并测定黄芩苷含量。三批样品黄芩苷的含量分别为38.52、38.18、37.56 mg/粒；RSD值分别为0.26%、0.28%、0.73%。

3 讨论

3.1 含量测定的选择

本品处方由六味中药药组成，君药柴胡中主要成分柴胡皂苷a、b、c、d，在研究中发现，柴胡皂苷a、d不稳定，在温和的条件下既可转化为具有双键的柴胡皂苷b1、b2[1]。故本试验中采用高效液相色谱法测定臣药黄芩中的有效成分黄芩苷含量，以便控制本品的内在质量。

3.2 柴胡提取方法的选择

柴胡供试液的制备是通过乙醚两次萃取来除去样品中部分脂溶性杂质， 再用氨试液洗涤以便进一步除去杂质。通过实验结果表明， 如果省略这两步操作，都会使柴胡鉴别的薄层色谱有干扰，无法观察到清晰的斑点[6]。

3.3 柴胡鉴别展开剂及显色剂的选择

本实验曾经用以[2-5]乙酸乙酯-乙醇-水（18∶2∶1）、乙酸乙酯-乙醇-水（8∶2∶1）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶50∶35∶20）的下层溶液、三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶1）10℃以下静置的下层液为展开剂，显色剂分别用1%对二甲氨基苯甲醛硫酸乙醇（110）溶液、2%对二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇（110）溶液、2%对二甲氨基苯甲醛40%硫酸溶液，效果均不佳。

3.4 含量测定流动相及提取方法的选择

用HPLC法测定黄芩苷含量，文献中[5-9]有多种流动相，其中以甲醇-水-磷酸溶液（47∶53∶0.2）为优，保留时间适中，峰形对称，分离度好。在制备含量供试品时，曾对比了超声法、回流法、乙醇和甲醇提取对供试品含量的影响，结果表明，采用超声法制备供试品虽比回流法简便快捷，但其黄芩苷的提取率低，因此决定采用回流法作为本实验中供试品溶液的制备方法，获得较好的含量测定结果。

3.5 山豆根鉴别

山豆根的主要化学成分为苦参碱和氧化苦参碱，氧化苦参碱不稳定，易转化为苦参碱[10]，本品在工艺制备过程中，通过试验证明氧化苦参碱没有完全转化成为苦参碱，因此选择苦参碱、氧化苦参碱对照品为本制剂中山豆根的定性控制指标。

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（收稿日期：2013-04-24 本文编辑：卫 轲）