古人类骨骼DNA降解影响因素分析

作者：杨周岐，张虎勤，张金,赵文明

【关键词】 羟基磷灰石

Degradative factor analysis of ancient DNA preserved in human bones

【Abstract】 The ancient DNA (aDNA), the most important genetic information of ancient human, has been widely used in the studies of human origin, evolution, racial character, migration and diseases, and herefrom the molecular archaeology has developed rapidly. By virtue of its special structure and physical specialty, the bones have often been selected as the ideal aDNA samples. Effected by the outside physical and chemical factors, enzymes and microorganism, the aDNA preserved in human bones will get degraded into small fragments during a long buried or exposed time. By analyzing the structure and specialty of bones, we discussed the preservation of bone structure and the effects of environmental factors on its decomposition and investigated the adsorption effect of matrix framework formed by bone inorganic phase hydroxyapatite and collagen via calcium bridge on aDNA fragments. Based on the analysis of the characteristics and stability of DNA, we discussed the damages of hydrolyzation, oxidation, enzyme and microorganism to aDNA and studied the influences of the environmental factors inclusive of temperature, humidity, pH value and microorganism on aDNA degrading rate. In the end, the survival age limit and the favorable preservation conditions of aDNA were suggested to provide theoretical evidences for the extraction, preservation, sampling and authenticity evaluation of aDNA.

【Keywords】 ancient DNA; degradation; bone; hydroxyapatite

【摘要】 古DNA是古代人类最重要的遗传信息载体，已用于人类起源、进化、族群特征、迁移、古代人类疾病等方面的研究，由此导致了分子考古学的兴起. 由于骨骼组织独特的结构和物理特性，其常常被选作较理想的古DNA研究组织样品. 在长期的埋藏和暴露过程中，受外界物理因素、化学因素、酶解及微生物侵染等作用，古人类骨骼DNA分子将发生一定程度的降解. 通过分析骨骼组织结构及其物理特性，探讨了骨骼组织的保存及影响其分解的环境因素，阐述了骨骼无机相羟基磷灰石与有机胶原质形成的嵌合结构对DN段的吸附保护作用. 在分析DNA分子的特点和稳定性的基础上，探讨了水解反应、氧化反应、酶解及微生物分解作用对古DNA分子造成的降解，研究了温度、湿度、pH值、微生物等环境因素对古DNA降解速率的影响. 在此基础上，分析了在不同条件下古DNA仍得以幸存的年代范围，提出了有利于古DNA保存的环境条件，从而为古DNA样品保存、研究取样、提取及真实性评估提供理论依据.

【关键词】 古DNA；降解；骨骼；羟基磷灰石

0引言

20世纪80年代以来，生物学家分别从古化石、陈旧皮张、土壤、牙齿和骨骼中成功提取了动物、植物及人类的细胞核DNA、线粒体DNA (mtDNA)片段和叶绿体DN段，从不同领域、不同视角进行研究，揭示了古DNA蕴藏的科学价值. 此后，以性别鉴定、亲缘关系确定、进化树构建和古代人类疾病为目标的分子考古研究得到了快速的发展［1］. 古DNA研究的成功与否，很大程度上依赖于所选组织样品的保存状况、提取方法、扩增引物设计和防止污染的技术措施［2］. 在长期的埋藏或暴露过程中，受环境因素和微生物作用，古人类软组织在短期内很快分解，进而导致其DNA分子迅速降解，造成软组织中古DNA提取困难及扩增成功率较低. 骨骼、牙齿等坚硬组织为古DNA保存提供了较理想的场所，一方面致密结构大大减弱了环境因素和微生物对组织结构的破坏作用，延缓了古DNA的降解过程；另一方面骨骼羟基磷灰石对古DN段具有吸附作用，这种作用使古DNA分子保存时间延长. 因此，古人类骨骼和牙齿已被广泛地选作DNA分子考古的组织样品［3］.

1骨骼组织结构及其分解

人类骨骼组织主要包括3种细胞，即骨细胞、成骨细胞和破骨细胞，其细胞间质主要由胶原质和羟基磷灰石［Ca10(PO4)6(OH)2］构成. 胶原质由骨细胞分泌产生，约占骨重的30%，具有较高的变性温度（超过90℃）和良好的热稳定性［4］. 羟基磷灰石约占干骨质量的65％～75％，是骨骼结构支撑物质，具有表面活性, 结构呈细针状，沿胶原纤维的长轴排列，主要以六方体晶体形态和非晶态形式存在［5］. 胶原质与羟基磷灰石通过钙桥连接形成的嵌合结构具有一定的空间效应［3］，弱碱性条件下DN段带负电，在羟基磷灰石晶体表面可以形成化学吸附，这对古DNA的保存相当有利. 在长期埋藏过程中，骨骼组织中非晶态的羟基磷灰石将逐渐转变为晶体结构［6］，这种晶态的转变对古DNA的保存有两方面影响：一方面结晶使骨骼硬度增强，可减缓外部环境因素的侵蚀；另一方面，结晶度的增加减小了羟基磷灰石的吸附表面积，使古DNA的保存空间减小. 羟基磷灰石晶态结构的改变和可逆分解将加速微生物对骨胶原质的分解，促使胶原质逐渐分解或矿化，同时胶原质的存在也将有效延缓羟基磷灰石的分解速率.表1影响古DNA降解的因素及结果（略）

在埋藏环境中，骨骼组织主要发生3种形式的分解［3］：胶原质水解、骨矿物质分解及微生物的分解作用. 当骨骼与埋藏环境处于热力学平衡时，骨胶原质的化学水解占主导地位，常常导致骨骼发生矿化. 游离态H2O的存在对骨骼的保存极为不利，可加速胶原质的水解和羟基磷灰石的溶解. 当温度变化时溶解的羟基磷灰石重新结晶，表面吸附F-，Sr2＋，Mg2＋，SiO32-和CO32-等离子，这些离子与矿物离子间的交换将导致骨骼晶体结构发生改变. 在强酸或强碱性条件下，羟基磷灰石的结构将被完全破坏，胶原质肽键也将水解形成肽片段（对碱催化更敏感）. 胶原质的矿化使骨结构组织发生降解，造成古DNA赖以存在的物质基础和保护屏障的破坏，势必导致古DNA的稳定性大幅降低.

样品组织中影响氨基酸残基外消旋反应的因素同样影响DNA链的脱碱基过程. 在构成蛋白质的氨基酸中，天冬氨酸（Asp）的外消旋反应速率最快，其速率和反应活化能与DNA水解脱碱基的速率和活化能相当. 实验研究发现，当Asp的D/L比率超过0.08时即很难提取到有用的DN段（极限值为0.1），这一比率越低，提取的DN段越长. 因此检测骨组织中氨基酸外消旋反应速率可以为确定样品中是否含有古DN段提供证据［7］.

2DNA的降解

目前，分子考古研究主要集中于核DNA和线粒体DNA（mtDNA）方面. mtDNA属细胞核外遗传物质，在细胞内有几千个拷贝，片段较小，受酶解及外界因素作用位点少，因而降解速度相对较慢；核DNA分子相对较大，降解速度快，相比较而言mtDN段比核DN段提取的成功率略大. 水解反应、氧化反应及微生物分解反应是造成DNA降解的主要原因［8］.

2.1水解反应水解反应首先发生在碱基与糖环相连的N－糖苷键上，反应主要受酸催化驱使. 当双链DNA变性形成单链时，水解反应更易发生. 如对双链和单链DNA来说，其碱基水解的速率相差4倍. 对不同碱基来说，水解的速率差异更大，如鸟嘌呤和腺嘌呤的水解速度相当，而胞嘧啶与胸腺嘧啶的水解速度仅为前者的5％. 由于羟基磷灰石的吸附作用，骨骼组织中DNA的脱碱基速度将减慢一半［9］，当维持DNA单链稳定的主要作用力磷酸二酯键水解断裂后，将形成许多DNA短片段.

酸、碱催化作用都可导致碱基本身水解脱去氨基（如胞嘧啶脱氨基形成尿嘧啶，腺嘌呤脱氨基形成次黄嘌呤）. 由于双螺旋结构的保护作用，DNA双链碱基的脱氨基速率相对减慢，如对单链DNA来说，在37℃，pH 7.4的溶液中，胞嘧啶转化为尿嘧啶的半衰期为200年，而双链DNA胞嘧啶的脱氨基速度仅是单链DNA的0.5％～0.7%，这意味着在相同条件下双链DNA胞嘧啶的半衰期可达3万年. 嘌呤碱基的脱氨基反应则较少发生，如腺嘌呤脱氨基生成次黄嘌呤的速率仅为胞嘧啶脱氨基速率的2％～3％［10］.

影响水解反应的因素①温度：古DNA经历的热历史对其稳定性有很大的影响，热历史涉及古DNA保存环境的平均温度及温度波动. 通过下式可对骨骼DNA分子脱碱基速率进行估算［11］：K=Aexp(-Ea/RT)（pH 7.4，其中：Ea=127 kJ/mol，A=3.26×1011/s, R=8.314 J/kmol,T为热力学温度）. 经计算可知，古DNA在0℃保存12万5000年，10℃保存1万7500年，而在20℃下仅保存2500年［12］. 从化学降解来说，温度降低20℃，生物大分子的分解速率降低10～25倍，因此低温环境对古DNA的保存最为有利［13］. 低温条件限制了微生物的活性，降低了液态水的含量，使得主要依赖液态水而发生的化学分解及生物降解速率大大降低. 如经过试管内降解实验(70℃，pH 7.4)表明，水溶液中DNA自发脱嘌呤的速率为4×10-9/s，由此估计古DNA分子可以保存的理论极限为10万年. 研究还发现热诱导产生的脱氨基速率比酸碱催化的脱氨基速率更高，因此从埋藏学的角度来看，低温环境无论从物理、化学及生物学方面均有利于DNA分子的保存. ②pH值：弱酸性环境中，如pH 4.0时，连接嘌呤与核糖的糖苷键会发生断裂（碱基甲基化后更易发生）；当pH小于1时，DNA的磷酸二酯键则会水解断裂. 强碱性环境中，嘌呤分子结构会发生酮式与烯醇式结构的转变，影响特定碱基间的氢键作用，导致DNA双链发生变性. 因此，无论在强酸性或强碱性环境中，都使DNA结构发生变化，进而加速DNA的降解. ③湿度：游离态H2O的存在将直接促使DNA分子水解，这在一定程度上是难以避免的，因为样品保存环境和骨质孔状结构为H2O的存在提供了条件. 环境湿度大，有利于水解反应的发生，并促使羟基磷灰石与古DNA发生脱附作用；湿度较小或极度干燥，则使DNA结构发生变化. ④离子强度：高离子强度的可溶盐体系中，磷酸二酯键分解速率可减慢5~10倍［9］. 这是由于DNA链上PO43-带负电荷，造成DNA分子间存在排斥，在高盐浓度下，负电荷被中和,其斥力降低，使得DNA稳定性相对提高.

2.2氧化反应DNA的氧化主要发生在碱基残基上，导致碱基的缺失或更迭. 由于线粒体是有氧代谢的中心，因此mtDNA比核DNA更易受到氧化作用的影响. 在氧气、超氧化物、过氧化物及羟基自由基等活性氧多位点攻击下，DNA碱基发生修饰进而产生一系列氧化产物［14］. ①嘌呤碱基的氧化：最易产生的氧化产物是8羟基鸟嘌呤，其优先与腺嘌呤结合而不是与胞嘧啶配对，破坏了DNA最初的氢键结构，从而降低DNA的稳定性. 其次还生成8羟基腺嘌呤、4,6二氨基5甲酰胺腺嘌呤、2,6二氨基4羟基5甲酰胺鸟嘌呤等氧化产物. 这些产物从根本上改变了DNA分子的基本组成，最终使DNA分子完全降解［15］. ②嘧啶碱基的氧化：嘧啶碱基被氧化形成环状饱和结构，如5羟基5甲基乙内酰脲、5羟基乙内酰脲（胸腺嘧啶的降解产物）及较少的5羟基尿嘧啶和5,6二羟基尿嘧啶，它们可以进一步被氧化分解形成短片段. 还有一种氧化作用是由于在碱基和糖?磷酸骨架链之间以额外的共价键相连形成环状嘌呤脱氧核糖核苷，使DNA螺旋结构发生变形，进而导致DNA分子发生降解［9］.

影响氧化作用的因素①温度：低温条件下物质迁移速度降低，氧气及氧离子的活性受到抑制，从而降低DNA分子氧化速率. ②H2O：液态水是氧化反应的介导物质. 一方面H2O的渗透将溶解其中的氧气直接带进埋藏环境，另一方面H2O的存在促使氧离子的生成，进而加速DNA氧化速度. ③电磁辐射、紫外辐射（尤其UVB和UVC）及核辐射对古DNA的氧化也产生一定影响. 电磁辐射加强氧化性离子或分子的活性，导致超螺旋DNA向线性DNA分子的转变［16，17］. 紫外辐射促使DNA分子构型发生转变，并促进氧化剂的活性，导致DNA分子的氧化降解作用加剧.

2.3酶解及微生物分解作用核酸酶及土壤微生物对DNA的降解作用是相当重要的一个因素. 真核生物核DNA与组蛋白结合以核小体基本单位存在，缠绕于单个核小体八聚体组蛋白核心上的DNA约为146 bp，已提取的古DN段绝大多数为100~200 bp，二者之间恰巧吻合. 这是由于核酸酶活性保持时间短，且对金属离子有依赖性，如钙、镁离子利于酶活性的保持，而高浓度钾离子抑制其活性［18］. 当组蛋白被降解后，核酸酶的活性已逐渐丧失，因此组蛋白阻止了核DNA被进一步酶解. 此外，酶解是一个需能过程，而封闭埋藏环境中由于氧的缺乏将切断其能源供应，因此核酸酶的降解作用受埋藏方式的影响. 当人体骨骼矿物组织及有机相得到破坏后，微生物对DNA的降解作用将非常显著. 通过研究土壤微生物（包括细菌、酵母及霉菌）对DNA的分解作用，发现微生物分解作用可生成一系列寡核苷酸，进一步降解则生成胸腺嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、尿嘧啶及胞嘧啶等残基［19］. 微生物分解作用与埋藏环境的温度、湿度、pH值等密切相关，低温、干旱的环境对微生物生长及酶活性有较强的抑制作用，有利于对古DNA的保存［20］.

3结论

综合以上分析，古人类骨骼DNA分子的降解与埋藏环境或放射性同位素〖〗UV辐射只破坏样品表面DNA，但可激活氧离子，加速DNA氧化过程代谢气体的形成及软组织破坏，可加速微生物的破坏作用，深度埋藏将大大减弱辐射作用，有利于古DNA的保存因素如温度、湿度、土壤特性、微生物及组织分解产生的有机物（如腐殖酸、棕黄酸）等密切相关. 低温、干旱、弱碱性及微生物较少的封闭环境对古DNA的保存最为有利（表1）. 我国西北、华北、东北地区年平均温度较低，土壤湿度小，分布着众多的考古遗址，是分子考古研究选样较为理想的地区. 在进行古DNA组织取样时，需根据埋藏地的实际环境因素做全面的分析，综合考虑导致DNA分子发生水解、氧化反应的因素及微生物种类，同时结合物理、化学方法对骨质结构及成分进行分析，以便为古DNA的提取、组织选样及真实性评估提供依据.

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