马鹿茸干品多肽降糖活性研究

《药物生物技术杂志》2014年第二期

1实验方法

1.1马鹿茸干品总肽粗品的制备马鹿茸干品经50%乙醇浸泡1w，切片，37℃烘干。称取60g鹿茸切片，粉碎成粉末，5mmol/LHAc-NaAc(pH3.5)缓冲溶液900mL浸提，4℃磁力搅拌16h。10000r/min离心20min，收集上清，40%的乙醇沉淀，4℃静置3h。10000r/min离心20min，收集上清，经0.45μm滤膜过滤，滤液35℃下旋转蒸发浓缩至300mL，加去离子水至900mL复溶，0.45μm滤膜过滤，得马鹿茸干品总肽溶液，冻干后为鹿茸总肽粗品。

1.2马鹿茸多肽分离纯化及分子质量测定将总肽溶液经10000MWCO(PES)超滤膜包超滤，透过液再用5000MWCO(PES)超滤膜包截留浓缩，得Mr5000～10000组分。该组分经Superdex30凝胶层析柱、C18反相柱。分离所得多肽Mr委托中国科学院上海生命科学研究院生物化学和细胞生物学研究所蛋白质组研究分析中心采用MALDI-TOFMS测定。

1.3马鹿茸总肽体内降糖作用的研究

1.3.1小鼠糖尿病模型的建立［11］60只雄性C57BL/6J小鼠(6～8w)根据体重随机分为正常对照组和造模组，正常对照组小鼠给予基础饲料，造模组小鼠给予高脂饲料喂养，实验前适应性喂养lw。夜间禁食不禁水10h，造模组小鼠给予ipSTZ(50mg/kg，4℃避光保存;用10mmol/L的柠檬酸缓冲液在冰浴下配制成1%STZ溶液，调至pH4.5，现用现配)，其他动物给予相应体积柠檬酸缓冲液。连续给药7d。给药结束1w后，夜间禁食不禁水10h，检测各实验组的空腹血糖，血糖≥16.5mmol/L者造模成功。

1.3.2马鹿茸总肽对糖尿病小鼠血糖的影响将造模组小鼠随机分为5组:糖尿病模型组(ip等体积生理盐水)，阳性药对照组(二甲双胍200mg/kg灌胃)，鹿茸总肽高(300mg/kg)，中(150mg/kg)，低(75mg/kg)剂量组。正常对照组ip等体积生理盐水。盐酸二甲双胍和鹿茸总肽按所要求的剂量分别溶于生理盐水，动物摄食、饮水自由。阳性对照组每天定时灌胃一次，其余各组小鼠每天定ip一次，持续给药5w，每周眼眶取血进行空腹血糖值的测定，监测给药后小鼠空腹血糖水平。

1.4鹿茸多肽DAP对STZ损伤的胰岛β细胞修复的影响［12］RINm5f细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，37℃，5%CO2培养。0.25%胰蛋白酶消化，每3d按1∶4的比例传代。将对数生长期的RINm5f细胞调整浓度为106个/mL，每孔100μL铺于96孔板中，37℃，5%CO2培养至细胞完全贴壁。吸去孔中培养液，加入100μL无血清培养基配制的4mmol/LSTZ损伤4h。正常对照组加入100μL无血清培养基。设空白对照组、模型组、阳性药对照组(Exendin-4终浓度20nmol/L)、DAP组(2，20，200nmol/L)，每组设5个复孔。给药48h后，MTT法检测细胞存活率，考察不同浓度DAP对STZ损伤后胰岛β细胞的修复作用。

1.5数据处理实验数据以x珋±s表示，用Excel软件统计分析，t检验进行组间比较，P＜0.05认为具有显著性差异，P＜0.01认为具有极显著性差异。

2实验结果

2.1粗品的提取将马鹿茸干品采用醋酸缓冲液提取、醇沉、旋蒸浓缩和冻干，得到粗品，为淡黄色粉末，BCA法测定蛋白含量，BSA作标准曲线，计算得到回归方程为:y=0.001x+0.0044(R2=0.9984)。测得收率为7.4‰。

2.2马鹿茸多肽纯化及相对分子质量测定多肽粗品经过超滤分离、分子筛层析、反相层析纯化获得一个多肽组分，命名为DAP，采用MALDI-TOFMS测定DAP分子质量，DAP在质谱图上呈现明显的分子离子峰，Mr为7214.36。

2.3马鹿茸总肽对糖尿病小鼠空腹血糖水平的影响马鹿茸总肽对糖尿病小鼠空腹血糖水平的影响如图1所示，STZ造模7d后，小鼠空腹血糖水平迅速上升，糖尿病模型组空腹血糖量在2～7w内稳定在17.5mmol/L左右，表明模型建立成功且稳定。随着给药时间的延长，鹿茸总肽低、中、高剂量组空腹血糖量与糖尿病模型组比较均有所降低，且有较好的剂量依赖性，其中高剂量组降血糖效果与阳性药对照组相仿。3.4DAP对STZ损伤的胰岛β细胞修复的影响DAP对损伤的胰岛β细胞修复的影响如图2所示，模型组细胞数目较正常对照组显著减少(P＜0.01)，表明STZ损伤模型造模成功。与模型组比较，DAP低、中、高剂量组均表现出显著地促进损伤RINm5f细胞修复活性。

3讨论

在糖尿病的发生中胰岛素抵抗和β细胞的功能障碍起有极为重要的作用［14-15］。故促进β细胞增殖及损伤β细胞的修复是治疗糖尿病的关键。本实验首先提取获得鹿茸总肽，动物实验表明其具有降低STZ诱导糖尿病小鼠空腹血糖量的活性，且呈现明显的剂量依赖性。为考察复合物中发挥降糖作用的组分，本实验进而对总肽进行分离纯化获得一种未曾报道的分子量为7214.36的多肽DAP。作者曾对DAP进行LC-MS-MS鉴定(结果未显示)，结果表明其并非胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，说明该肽可能是一种新肽。体外活性研究表明DAP对STZ损伤的RINm5f细胞增殖有明显的促进作用，并呈现浓度依赖性。表明DAP可能是鹿茸总肽发挥降血糖作用的活性成分之一，作用机理为修复损伤的胰岛β细胞，这为更深入地研究其治疗糖尿病的作用提供了依据。

作者：张双健姜宁朱静尚靖姚文兵单位：中国药科大学生命科学与技术学院新药筛选中心