铁皮石斛F1代多糖和醇溶性浸出物变异规律研究

[摘要] 采用苯酚-浓硫酸法和醇溶性浸出物热浸法测定11个铁皮石斛F1代家系多糖和浸出物的含量，结果表明5月与2月采集的样品多糖质量分数分别为32、89%～43、07%，25、77%～35、25%，醇溶性浸出物质量分数分别为2、81%～4、85%，7、90%～17、40%，家系间存在显著差异；多糖含量低的亲本通过与多糖含量高的亲本杂交，能显著提高子代多糖含量，杂交优势明显，杂交育种是提高铁皮石斛多糖含量而进行品种选育的有效途径。采收时间显著影响铁皮石斛多糖和浸出物含量，所有家系5月采样多糖含量均高于2月，浸出物含量则相反，但不同家系变化幅度差别很大，各个家系有其自身规律，研究铁皮石斛优良家系（品种）多糖和浸出物积累规律，确定其最佳采收时间，对充分发挥优良品种作用、提高药效具有重要意义。

[关键词] 铁皮石斛；种内杂交；多糖；浸出物

[收稿日期] 2013-04-04

[基金项目] 浙江省重大科技专项（2012C12912，2011C12002）

[通信作者] *斯金平，教授，主要从事药用植物品种选育，E-mail：lssjp@163、com 铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo具有益胃生津、滋阴清热等功效，多糖和醇溶性浸出物分别代表铁皮石斛的大极性和中小极性主要成分，与药理作用有着密切的联系[1-6]。2010年版《中国药典》在“含量测定”项中规定干品铁皮石斛多糖质量分数不得低于25、0%，甘露糖规定质量分数为13、0%～38、0%，浸出物规定醇溶性浸出物不得低于6、5%[7]。本文通过11个铁皮石斛F1代家系22个样品多糖和醇溶性浸出物含量测定，了解铁皮石斛种内杂交F1代多糖和浸出物的含量变异规律，为铁皮石斛良种选育提供依据。

1 材料

紫外-可见分光光度计（Thermo Scientific GENESYS 10s UV-VIS）；KQ-500DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DK-S24型电热恒温水浴锅（上海森信实验仪器有限公司）；D-37520型高速离心机（德国 Heraeus公司）；AB104-N电子分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；DHG-9070HA精密型强制对流干燥箱（杭州蓝天化验仪器厂）。葡萄糖对照品（购自中国食品药品检定研究院，批号110833-200904）；重蒸酚（北京索莱宝科技有限公司）；其他所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

2012年5月1日和2013年2月6日，先后采集浙江省义乌市佛堂镇高效生态农业示范园区丹溪药博园内6a×2b，9×66，17×30，17×71，30×83，65×91，78×69，86×56，99×31，124×140等10个F1代全同胞家系和森山1号（CK）二年生萌条（铁皮石斛萌蘖生理年龄），共22个样品。每个样品采样不少于25个萌条，1丛植株只采1个萌条，采样植株间隔2 m以上。采集的样品在80 ℃杀青2 h，60 ℃烘至恒重，粉碎，过60目筛，待用。供试亲本主要性状详见表1。

2 方法

2、1 多糖含量测定 参照2010年版《中国药典》（一部）苯酚-浓硫酸法进行测定[7]。精密称定样品粗粉0、3 g，加水200 mL，加热回流2 h，趁热过滤，将滤液转移至250 mL量瓶中，用少量水分次洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀。精密量取续滤液5 mL，置50 mL离心管中，精密加入无水乙醇25 mL，摇匀，冷藏1 h，取出，离心（转速为4 000 r・min-1）20 min，弃去上清液，沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次20 mL，离心，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至50 mL量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀。精密量取1 mL样品溶液，加5%苯酚溶液1 mL，混匀，精密加浓硫酸5 mL，混匀，静置5 min，沸水浴中加热20 min，取出，置冰浴中冷却5 min，以1 mL水为空白，于488 nm处比色，试验平行3 次。以葡萄糖标样制作标准曲线，其回归方程为Y=8、911 4X-0、056 6，R2=0、998 4，其中，Y为吸收度，X为浓度。

2、2 浸出物含量测定 参照2010年版《中国药典》（一部）附录ⅤA项下热浸法测定，以乙醇作溶剂[7]。精密称定样品粗粉2 g，置100 mL具塞圆底烧瓶中，精密加乙醇50 mL，密塞，称重，静置1 h后，在85 ℃热水浴中回流，保持微沸1 h，放冷后取下量瓶，密塞，用乙醇补足失重，摇匀，用干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃烘箱干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称重，以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的含量。试验平行3次。

2、3 数据统计与分析 利用Excel 2003对所测数据进行整理，SPSS 18、0软件进行单因素方差分析和Duncan新复极差测验的多重比较分析。

3 结果与分析

3、1 F1代家系间多糖含量差异 供试F1代家系多糖含量测定结果和Duncan新复极差测验的多重比较结果见表2。

从表2可见，2012年5月1日采集的样品多糖质量分数为32、89%～43、07%，多数多糖含量低的亲本通过与多糖含量高的亲本杂交，能显著提高子代多糖含量，杂交优势明显。Duncan新复极差测验的多重比较结果表明，6a×2b，65×91家系的多糖含量显著高于CK与其他家系，78×69，86×56，99×31家系多糖含量与CK比较差异不显著，124×

140显著低于CK与其他家系。2013年2月6日采集的样品多糖含量分别为25、77%～35、25%，86×56，17×71，99×31家系多糖含量显著高于CK与其他家系，30×83，65×91，78×69和124×140等家系与CK无显著差异，6a×2b，9×66家系显著低于其他家系。

采样时间对多糖含量存在极显著的影响，所有家系5月采样多糖含量均高于2月，但不同家系变化幅度差别很大，如6a×2b家系2月6日采样多糖含量位居供试家系末位，5月1日采样多糖含量位居首位，两者含量相差16、86%，124×140家系变化幅度最少。产生多糖幅度差别很大原因可能与各家系的生长规律有关，在浙江义乌试验地，17×71家系通常10月初停止生长，而6a×2b家系至11月中旬才封顶，后期光合作用可产生更多的多糖。

3、2 F1代家系间浸出物含量测定 供试F1代家系浸出物含量测定结果和Duncan新复极差测验的多重比较结果见表3。

从表3可见，2012年5月1日采集的样品浸出物质量分数为2、81%～4、85%， Duncan新复极差测验的多重比较结果表明，6a×2b，9×66，17×71，65×91，78×69，86×56，124×140等7个家系的浸出物含量显著高于CK，其中9×66家系浸出物质量分数最高，为4、85%；17×30，99×31家系与CK比较差异不显著。2013年2月6日采集的样品浸出物质量分数分别为7、90%～17、40%，6a×2b，17×

30家系浸出物含量显著高于CK与其他家系，9×66，17×71，30×83，65×91，78×69，86×56，99×31，124×140等家系与CK无显著差异。家系间浸出物含量存在极显著差异，说明品种选育是提高铁皮石斛浸出物含量的有效途径。采收时间同样显著影响浸出物含量，但与多糖积累规律相反，2月采收普遍高于5月，多糖变幅大的家系浸出物含量变幅也大，6a×2b家系2次浸出物含量相差12、98%。

4 结论与讨论

供试11个铁皮石斛F1代家系多糖和浸出物含量测定结果表明，供试样品采自同一产地，栽培环境、基地管理均一致，家系间多糖和浸出物含量仍存在显著差异，说明这种差异主要来自遗传差异，品种选育是提高铁皮石斛多糖和浸出物含量的有效途径；多数多糖含量低的亲本通过与多糖含量高的亲本杂交，能显著提高子代多糖含量，杂交优势明显，说明就铁皮石斛而言，杂交育种是提高多糖含量而进行品种选育的有效途径；研究结果同时表明，产量高的品种可同时具备高多糖和醇溶性浸出物含量，通过品种选育，优质高产可同时实现。采收时间显著影响铁皮石斛多糖和浸出物含量，并具有规律性，2月采集的样品浸出物含量明显高于5月采集的样品，而多糖含量明显低于5月采集的样品，而各个家系多糖与浸出物的积累又有其自身规律，特别是一些产量较高的优良家系（如6a×2b），不同采收季节变化幅度更大。

2010年版《中国药典》规定，铁皮石斛“11月至翌年3月采收”，“浸出物”项中规定“醇溶性浸出物不得低于6、5%”，“含量测定”项中规定“干品铁皮石斛多糖含量不得低于25、0%”。供试家系2013年2月6日采集的样品多糖和浸出物质量分数分别为25、77%～35、25%，7、90%～17、40%，均能达到要求。但开花前采收能显著提高多糖含量[9]，本研究供试11个家系5月采收多糖质量分数为32、89%～43、07%，比2月采收高8、08%，但5月采收浸出物质量分数为2、81%～4、85%，全部不能达标。因此，进一步开展铁皮石斛多糖与醇溶性浸出物的功效，以及铁皮石斛不同家系（品种）多糖和浸出物积累规律研究，然后根据铁皮石斛功效成分的要求确定其最佳采收时间，对充分发挥优良品种作用、提高铁皮石斛药效具有重要意义。

[参考文献]

[1] 侯少贞， 李焕彬， 郭建茹， 等、 铁皮石斛镇痛与抗炎作用研究[J]、 动物医学进展， 2012， 33 （10） ： 49、

[2] 吴维佳， 庞璐， 胡曰红， 等、 铁皮石斛对小鼠免疫功能的影响[J]、 湖南中医杂志， 2012， 28 （2） ： 113、

[3] 李光， 宋美芳， 李宜航， 等、 不同种类石斛多糖成分对小鼠脾脏免疫功能的影响[J]、 中国临床药理学与治疗学， 2012， 17 （10） ： 1108、

[4] 蒋玉兰， 罗建平、 药用石斛多糖药理活性及化学结构研究进展[J]、 时珍国医国药， 2011， 22 （12） ： 2986、

[5] 何铁光，杨丽涛，李杨瑞，等、 铁皮石斛原球茎多糖DCPPla_1的理化性质及抗肿瘤活性[J]、 天然产物研究与开发， 2007， 19 （4） ： 578、

[6] 屠国昌、 铁皮石斛的化学成分、药理作用和临床应用[J]、 海峡药学， 2010， 22 （2） ： 70、

[7] 中国药典、一部[S]、 2010： 266、

[8] 诸燕， 斯金平， 郭宝林， 等、 人工栽培铁皮石斛多糖含量变异规律[J]、 中国中药杂志， 2010， 35 （4） ： 427、

[9] 金小丽， 苑鹤， 斯金平， 等、 开花对铁皮石斛多糖质量分数及单糖组成的影响[J]、 中国中药杂志， 2011， 36（16）： 2176、

Quantitive variation of polysaccharides and alcohol-soluble extracts in

F1 generation of Dendrobium officinale

ZHANG Xiao-ling1， LIU Jing-jing1， WU Ling-shang1， SI Jin-ping1*， GUO Ying-ying1， YU Jie2， WANG Lin-hua3

（1、Nurturing Station for State Key Laboratory of Subtropical Silviculture， Zhejiang Agricultural and Forestry University，

Key Laboratory of Varieties Created and Ecological Cultivation of Dendrobium officinale for National Chinese

Traditional Medicine Administrative Bureau， Zhejiang Provincial Strategic Alliance for Technical Innovation in Industry of

Dendrobium officinale， Lin′an 311300， China；

2、Fenghua Jiuwei Shengcaotang Professinal Cooperatives of Dendrobium officinale， Fenghua 315500， China；

3.Zhejiang Jiacheng Biological Engineering Co.， Ltd.， Yiwu 322002， China）

[Abstract] Using phenol-sulfuric acid method and hot-dip method of alcohol-soluble extracts， the contents of polysaccharides and alcohol-soluble extracts in 11 F1 generations of Dendrobium officinale were determined. The results showed that the polysaccharides contents in samples collected in May and February were 32.89%-43.07% and 25.77%-35.25%， respectively， while the extracts contents were 2.81%-4.85% and 7.90%-17.40%， respectively. They were significantly different among families. The content of polysaccharides in offspring could be significantly improved by hybridization between parents with low and high polysaccharides contents， and the hybrid vigor was obvious. Cross breeding was an effective way for breeding new varieties with higher polysaccharides contents. Harvest time would significantly affect the contents of polysaccharides and alcohol-soluble extracts. The contents of polysaccharides in families collected in May were higher than those of polysaccharides in families collected in February， but the extracts content had the opposite variation. The extents of quantitative variation of polysaccharides and alcohol-soluble extracts were different among families， and each family had its own rules. It would be significant in giving full play to their role as the excellent varieties and increasing effectiveness by studying on the quantitative accumulation regularity of polysaccharides and alcohol-soluble extracts in superior families （varieties） of D. officinale to determine the best harvesting time.

[Key words] Dendrobium officinale； intraspecific hybridization； polysaccharides； alcohol-soluble extracts

doi：10.4268/cjcmm20132117