铁皮石斛多糖促进毛发生长的实验研究

[摘要]目的：观察铁皮石斛多糖（DCP）促毛发生长的功效并探讨其作用机制，为铁皮石斛的开发利用奠定基础。

方法：采用水提醇沉法提取DCP，并用苯酚-硫酸法测定其多糖含量。取C57BL/6J小鼠30只，用脱毛膏去除其背部毛发建立脱发模型，分为对照组、阳性对照组和DCP组，每日分别涂抹超纯水、米诺地尔酊、DCP（5.0 g・L-1）l 次，每次 0.2 mL，连续给药21 d，应用小鼠毛发生长情况评分标准对C57BL/6J小鼠给药7，14 d毛发生长情况进行评分，及称量给药21 d C57BL/6J小鼠单位脱毛区域毛发质量评价DCP对C57BL/6J小鼠毛发生长的影响。采用MTT法和RT-PCR法分别评价DCP对人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）增殖和对HaCaT细胞血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达的影响。

结果：DCP提取率为29.87%，DCP质量分数为79.65%。DCP组C57BL/6J小鼠的毛发生长平均得分、平均质量均显著优于对照组；DCP组HaCaT细胞生存率和VEGF mRNA的表达水平与对照组比较均显著提高。

结论：DCP具有促毛发生长的作用，其机制可能是上调VEGF mRNA的表达。

[关键词]铁皮石斛多糖（DCP）；毛发生长；血管内皮细胞生长因子（VEGF）

[收稿日期]2013-07-08

[基金项目]国家自然科学基金项目（81102674，81274157，30850012）；广东省自然科学基金项目（S2011010005661，06024128）；广东省科技计划项目（2011B031700076，2009B060700070，2007B020704005，2009A030100003，2009B090300335）

[通信作者]*魏小勇，教授，主要从事中药生物工程研究，Tel：13113989538， E-mail：；*孙兴力，副教授，主要从事生药提取分离研究，E-mail：

[作者简介]陈健，硕士研究生，E-mail：脱发作为一种毛发疾病，对患者的精神、心理健康及社会交往产生较大的影响。目前防治脱发方法主要有手术治疗和药物治疗。手术治疗作为一种创伤性的治疗方法，可出现出血、感染、肿胀、瘢痕增生、表皮样囊肿等并发症[1]，且费用昂贵。药物治疗则通过促进毛发生长来防治脱发，常用药物有米诺地尔，非那雄胺，RU58841，环孢素A（CyA），FK506等，但都存在一定的缺陷[2]。因此，开发高效、作用机制明确、无毒副作用的防治脱发的药物具有重要的社会意义和经济意义。铁皮石斛是兰科石斛属植物，具有广泛的药理作用。铁皮石斛多糖（Dendrobium candidum polysaccharides，DCP）是铁皮石斛主要成分之一。本研究采用水提醇沉法提取DCP，观察其促毛发生长的功效并初步探讨其作用机制，为铁皮石斛的开发利用奠定基础。

1材料

1.1动物与细胞株C57BL/6J小鼠，SPF级，雌性，6～8周龄，体重18～22 g，由中山大学实验动物中心提供，合格证号0111468。HaCaT细胞株购于北京北纳创联生物技术研究院。

1.2药物与试剂铁皮石斛由广东永生源生物科技有限公司提供，广州中医药大学魏小勇教授鉴定。杏仁乳液型脱毛膏（法国薇婷香港有限公司）；米诺地尔酊（浙江万马药业有限公司）；胎牛血清（FBS），RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；青-链霉素（美国HyClone公司）；0.25%胰蛋白酶（美国Gibco公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，美国Amresco公司）；6孔细胞培养板（美国康宁公司）；10 cm细胞培养皿（美国康宁公司）；RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）；通用型RT-PCR试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；VEGF及β-actin引物（上海英潍捷基生物技术有限公司）；琼脂糖（西班牙BIOWEST公司）； TAE缓冲液，50×（广州瑞舒生物科技有限公司）。

1.3仪器GL-21M高速冷冻离心机（上海卢湘仪离心机仪器有限公司）；Laborota 4000旋转蒸发仪（德国Heidolph公司）；DLSB-5L/10低温冷却液循环泵（巩市予华仪器有限责任公司）；TC-15套式恒温器（海宁新华医疗器械厂）；FD-1-50真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；BDS200倒置显微镜（重庆奥特光学仪器有限责任公司）；SCIENTIFIC细胞培养箱（美国Thermo公司）；1300 SERIES A2生物安全柜（美国Thermo公司）；iMark 680 酶标仪（美国BIO-RAD公司）；LIBROR AEG-220电子分析天平（日本岛津公司）；TDZ5-WS离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；UV-1800型紫外检测器（日本岛津公司）；2400型PCR仪（新加坡Applied Biosystems公司）；DYY-2C型电泳仪（北京六一仪器厂）；Gel Doc XR+凝胶成像系统（美国BIO-RAD公司）。

2方法

2.1DCP的提取及其含量测定铁皮石斛粉末过3号筛（50目），100 g粉末加入3 000 mL的纯水，回流提取2 h，结束后倒出提取液，再向药渣中加入相同体积纯水，继续回流提取2 h，共提取3次，合并3次水提液，浓缩至原体积的1/4，向浓缩液中加入3倍体积量95%乙醇进行沉淀，静置过夜。将上述溶液离心20 min（6 000 r・min-1），取下层沉淀物，用80%乙醇洗涤2次后减压过滤，得到的沉淀物经冷冻干燥，最终得到水提物冻干粉29.87 g，即DCP，冷藏备用。计算提取率，提取率=多糖质量/药材质量×100%。

取无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加水配制成90 mg・L-1溶液，即多糖对照品溶液。量取对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置10 mL具塞试管中，各加水补至1.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL（临用配制），摇匀，再加硫酸5.0 mL，摇匀，置沸水浴中加热20 min，取出，置冰浴中冷却5 min，以蒸馏水为空白对照，在488 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

称取待测DCP 0.01 g溶于100 mL蒸馏水中，取1 mL置10 mL具塞试管中，自“加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出DCP溶液中无水葡萄糖的量，计算，即得DCP的含量。

2.2C57BL/6J小鼠脱发模型的建立用剃毛刀剃除C57BL/6J小鼠背部的毛发，面积约为2 cm×3 cm，然后按说明书涂抹脱毛膏，去除残留的毛发，确认C57BL/6J小鼠毛发生长处于休止期（皮肤呈粉色），以建立C57BL/6J小鼠脱发模型。

2.3分组及给药C57BL/6J小鼠随机分成对照组、阳性对照组和DCP组，每组10只，每日分别涂抹超纯水、米诺地尔酊、DCP（5.0 g・L-1，溶液为超纯水）l 次，每次 0.2 mL，连续涂抹21 d。

2.4C57BL/6J小鼠毛发生长情况评分及毛发质量称量参考文献方法[3]，第7，14天分别给C57BL/6J小鼠拍照及毛发生长情况评分，评分标准如下：未生长，脱毛区皮肤呈肉色为0分，脱毛区皮肤呈灰色为1分，脱毛区皮肤呈黑色为2分，脱毛区皮肤呈黑色并有少许毛发长出为3分。给药21 d后取C57BL/6J小鼠背部脱毛区皮肤，用20 mm打孔器于每鼠脱毛区相同位置取圆形皮片，用手术刀刮下皮片上所有体毛，分析天平称重，计算各组C57BL/6J小鼠毛发质量的均值。

2.5MTT法检测DCP对HaCaT细胞增殖的影响HaCaT细胞培养液按体积比为89%RPMI-1640培养基、10%FBS和1%青-链霉素配制，细胞接种于10 cm培养皿，置于温度为37 ℃，5%CO2的培养箱内培养。取对数生长期HaCaT细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，接种于96孔板，每孔约5 000个细胞，设对照组、DCP低、中、高剂量组共4组，每组6个复孔。孵育24 h，对照组不予处理，DCP低、中、高剂量组分别给予0.1，1.0，5.0 mg・L-1的DCP，培养12 h后，每孔加入5.0 g・L-1 MTT溶液20 μL，继续培养4 h，吸弃上清，每孔加DMSO 150 μL，水平摇床混匀，与酶标仪490 nm波长处测定吸光度A，以对照组细胞生存率为100%，计算其他组的细胞生存率，即细胞生存率=ADCP组/A对照组×100%。

2.6HaCaT细胞总RNA提取按2.5项的方法培养HaCaT细胞，取对数生长期的HaCaT细胞接种于6孔细胞培养板，每孔约20万个细胞，共4孔，分为对照组和3个DCP组。培养过夜后，对照组不给药，DCP组分别给予高、中、低剂量（5.0，0.5，0.1 mg・L-1）的DCP，12 h后按RNA提取试剂盒说明分别提取各组细胞总RNA，RNA保存于75%乙醇，-80 ℃低温冰箱中备用。

2.7RT-PCR法检测HaCaT细胞VEGF mRNA的表达按反转录试剂盒使用说明操作。反应体系如下：5×M-MLV Buffer 2 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，RTase M-MLV （RNase H-） 0.25 μL，RNase inhibitor 0.25 μL，总RNA 500 ng，加RNase Free dH2O 至总体积10 μL。反转录反应条件：30 ℃反应10 min，42 ℃保温1 h，70 ℃保温15 min后冰上冷却。cDNA溶液放置于-20 ℃保存备用。PCR反应体系如下：上述cDNA溶液 1 μL，Taq酶（5 U・μL-1） 0.25 μL，PCR Buffer （Mg2+ Plus） 5 μL，β-actin上游引物0.5 μL，β-actin下游引物0.5 μL， VEGF上游引物0.5 μL，VEGF下游引物0.5 μL，加dH2O至总体积25 μL。VEGF的PCR反应条件：94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s；58 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。β-actin的PCR反应条件：94 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s；53 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。

2.8统计学方法应用SPSS 17.0软件包进行统计学分析。C57BL/6J小鼠毛发生长情况得分和毛发质量用±s表示，C57BL/6J小鼠毛发生长情况得分及HaCaT细胞生存率采用单因素方差分析，C57BL/6J小鼠毛发质量采用秩和检验，显著性水平α=0.05。

3结果

3.1DCP的提取及其多糖含量测定DCP提取率为29.87%。实验制备葡萄糖标准曲线，得到回归方程Y=0.006 3X + 0.007 2（r=0.995 2）。回归分析表明，葡萄糖质量浓度在18～90 mg・L-1与吸光度呈良好的线性关系。在相同条件下，测得DCP的平均吸光度为0.509（n=3），即葡萄糖质量浓度为79.65 mg・L-1，提示所提取的DCP多糖含量为79.65%。

3.2C57BL/6J小鼠脱发模型的建立C57BL/6J小鼠脱毛区皮肤均呈粉色，毛发生长处于休止期，说明建立了C57BL/6J小鼠脱发模型。

3.3DCP对C57BL/6J小鼠毛发生长的影响给药7 d，对照组小鼠脱毛区皮肤呈粉色，DCP组和阳性对照组小鼠脱毛区皮肤呈灰色，甚至黑色。给药14 d，对照组小鼠脱毛区皮肤成灰色，DCP组和阳性对照组小鼠脱毛区皮肤呈黑色，并有少许毛发长出，见图1。给药14 d，DCP组小鼠毛发生长情况得分与对照组比较，差异显著（P

图1DCP对C57BL/6J小鼠毛发生长的影响

Fig.1The effect of DCP on C57BL/6J mice hair growth

表1C57BL/6J小鼠毛发生长情况得分（±s，n=10）

Table 1The scores of hair growth of C57BL/6J mice（±s，n=10）

组别7 d14 d对照0.00±0.001.33±0.52阳性对照0.33±0.523.00±0.001）DCP0.33±0.523.00±0.001）注：与对照组比较1）P

表2给药21 d DCP对C57BL/6J小鼠毛发质量的影响（±s，n=10）

Table 2The effect of DCP on the weight of C57BL/6J mice hair at 21 day（±s，n=10）

组别小鼠平均毛发质量/mg・cm-2对照1.29±0.32阳性对照 3.17±0.541）DCP2.28±0.801）注：与对照组比较1）P

3.4DCP对HaCaT细胞增殖的影响与对照组比较，DCP低、中、高剂量组均能明显促进HaCaT细胞的增殖（P

3.5DCP对HaCaT细胞VEGF mRNA表达的影响通过凝胶成像系统观察电泳结果，3个剂量DCP组（0.1，0.5，5.0 mg・L-1）与对照组比较，VEGF mRNA的表达明显上调，其中0.5，5.0 mg・L-1比0.1 mg・L-1作用效果更明显，见图3。

与对照组比较1）P

图2DCP对HaCaT细胞增殖的影响（n=6）

Fig.2The effect of DCP on the viability of HaCaT cell（n=6）

图3DCP对HaCaT细胞VEGF mRNA表达的影响

Fig.3Effect of DCP on the expression of VEGF mRNA in HaCaT cell

4讨论

C57BL/6J小鼠毛发呈周期性生长，毛发周期分为生长期、退行期和休止期，皮肤中的黑素细胞均分布于毛囊，仅在毛发生长期才并合成分泌黑素，并将黑素传递给角质形成细胞，使皮肤呈现黑色；在毛发退行期，黑素合成减少，皮肤逐渐由黑色变为灰色；休止期无黑素合成，皮肤呈粉色[4]，故可通过C57BL/6J小鼠皮肤颜色鉴别毛发生长周期。本研究采用脱毛膏去除C57BL/6J小鼠背部毛发，使C57BL/6J小鼠毛发生长处于休止期，建立了脱发模型，比传统的脱毛方法松香-石蜡脱毛法、Na2S脱毛法等更方便、易行，而且对实验动物的损伤较小。

血管内皮细胞生长因子（VEGF），又称血管通透因子或血管调理素，具有增加微静脉、小静脉通透性，促进血管内皮细胞分裂、增殖等作用，在新生血管形成过程中，起着重要作用，与毛发生长密切相关[5-6]。研究证实，处于生长期的头发毛囊表现出高度血管化，且与VEGF的表达相关[7-8]。此外，Yano等的研究发现，早期毛发生长期的头发毛囊或滤泡间角质形成细胞可检测到少量VEGF，而在中期，VEGF mRNA则高度表达。VEGF可通过诱导毛囊周围血管形成促进毛发生长，使毛发增粗[8]。米诺地尔是广泛应用于治疗脱发的药物，可以使毛发提前进入生长期，延长生长期时间，缩短休止期，可使毛囊增大[9]。HaCaT细胞可以合成与分泌VEGF[9-11]，促毛发生长药物可上调VEGF mRNA的表达，本文阳性药物的结果与Yoo等[12]报道的一致。

DCP是铁皮石斛中的主要成分之一，本研究证实其具有促进毛发生长的作用，可诱导小鼠毛发生长提前进入生长期，且能促进HaCaT细胞增殖和上调HaCaT细胞VEGF mRNA的表达，与米诺地尔促毛发生长的作用机制相似。因此，推测DCP可能通过上调VEGF mRNA的表达介导毛囊血管的新生，改善微循环，进而促进毛发生长。相比米诺地尔，DCP来源天然，且目前尚未发现副作用，具有广阔的开发应用前景，未来将深入研究其促毛发生长的确切机制。

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[13]Yoo H G， Chang I Y， Pyo H K， et al. The additive effects of minoxidil and retinol on human hair growth in vitro[J]. Biol Pharm Bull，2007，30（1）：21.

Experimental study on Dendrobium candidum polysaccharides on

promotion of hair growth

CHEN Jian1， QI Hui1， LI Jin-biao1， YI Yan-qun1， CHEN Dan1， HU Xiao-hong1，

WANG Mei-ling1， SUN Xing-li2*， WEI Xiao-yong1*

（1.School of Basic Medical Science， Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China；

2. Department of Pharmacology， Yongzhou Vocational Technical College， Yongzhou 425100， China）

[Abstract]Objective： To observe the effect and mechanism of Dendrobium candidum polysaccharides （DCP） in promoting hair growth， in order to lay a foundation for the development and utilization of D. candidum. Method： The water-extraction and alcohol-precipitation method was adopted to extract DCP， and the phenol-sulphuric acid method was used to determine its content. Thirty C57BL/6J mice were collected to establish the hair loss model with hair removal cream. They were randomly divided into the control group， the positive control group and the DCP group， and given 0.2 mL of ultra-pure water， minoxidil tincture and DCP （5.0 g・L-1） 21 days. The mice hair growth scoring standard was adopted to evaluate the hair growth of C57BL/6J mice at 7， 14 d. The hairs in unit hair-losing areas of treated C57BL/6J mice at 21 d were weighed to evaluate the effect of DCP on the promotion of hair growth. MTT assay and RT-PCR method were used to evaluate the effect of DCP on the proliferatin of HaCaT cells and the mRNA expression of VEGF in HaCaT cells. Result： The extraction percent of DCP was 29.87%， and its content was 79.65%. The average scores for the hair growth and weight of C57BL/6J mice of DCP group were much higher than the control group. The survival rate and mRNA expression of VEGF of HaCaT cells were much higher than the control group. Conclusion： DCP has the effect in promoting hair growth. Its mechanism may be related to the up-regulation of the mRNA expression of VEGF.

[Key words]Dendrobium candidum polysaccharides （DCP）； hair growth； vascular endothelial growth factor （VEGF）

doi：10.4268/cjcmm20140225