关于优良生防菌株筛选的探讨

摘 要：目的：测定7种生防微生物菌种室内毒力和比较室外小区防治同翅目昆虫温室白粉虱和桃蚜。方法：首先制备各种菌株发酵液，以温室白粉虱和桃蚜为研究对象，测定各种菌株发酵液对温室白粉虱和桃蚜这两种害虫的杀毒能力。结论：蜡蚧轮枝菌L-31、L-05和粉虱座壳孢F-85在离体条件下对温室白粉虱和桃蚜均表现出很强的杀灭毒力，校正累计死亡率（%）均在90%左右，与其它菌种间存在显著性差异；粉虱座壳孢对两种害虫的毒力较高，但室外防效不理想；苏云金芽孢杆菌Bt1、Bt2和球孢白僵菌Q-55、Q-27对温室白粉虱和桃蚜的毒力较弱。

关键词：温室白粉虱 桃蚜 高毒力 生防微生物

中图分类号：S433 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2013）03（a）-0159-02

近年来，国外的研究主要集中于生物防治[1]，从植物病害防治的角度来讲，生物防治就是利用生物及其代谢产物防治植物病害，控制病原物的方法。它的实质就是利用生物种间关系、种内关系，调节有害生物种群密度，即利用生物群防治生物群[2]。而国内的科研人员也开始大力开展微生物农药，生防微生物菌种也开始被很多科研人员看重并作出了一些相关报道，但关于现在研究最多的苏云金芽孢杆菌、球孢白僵菌、蜡蚧轮枝菌等菌种对温室白粉虱和桃蚜的高毒力作用对比筛选较少[3]。本文选取对同翅目昆虫温室白粉虱和桃蚜有较高毒力的生防菌种为研究对象，其中在甘肃省科学院生物实验基地进行温室白粉虱的小区防效试验，在甘肃省榆中县和平乡进行桃蚜的小区防效试验，为拓宽生防微生物的抗虫谱和进一步生产应用提供科学依据。

1 试验材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株

苏云金芽孢杆菌Btl和Bt2，球孢白僵菌Q-55、Q-27，粉虱座壳孢F-85，蜡蚧轮枝菌L-31和L-05均购于中国微生物菌种保藏中心，经实验室活化、虫体复壮后的保存菌株，灰霉病病原菌由实验室从一品红病叶上分离纯化而得。

1.1.2 培养基

细菌斜面培养基：牛肉膏0.8 g、酵母膏0.5 g、葡萄糖1.0 g、琼脂粉1.2 g、用蒸馏水定溶至l00 ml，调pH值为7.0。

细菌发酵培养液：蛋白胨5.0 g、酵母膏0.5 g、葡萄糖1.0 g、Na2HpO4.1.1 g、用蒸馏水定溶至100 ml，pH值为7.0。

真菌斜面培养基：酵母膏l.0 g、蛋白胨1.0 g、葡萄糖4.0 g、琼脂粉1.2 g，用蒸馏水定溶至l00 ml，调pH值为6.5。

真菌发酵培养液：酵母膏1.0 g、蛋白胨1.0 g、葡萄糖3.0 g、麦芽提取物1.0 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.15g，用蒸馏水定溶至100 ml，调pH值为6.5。

1.2 试验方法

1.2.1 单菌斜面菌种的培养

将活化或复壮的原菌种转接于优选的单菌斜面培养基上，真菌25 ℃恒温培养15天。细菌30 ℃恒温培养50小时备用。

1.2.2 各试验菌株发酵液的制备

将培养了足够时间且已经生成大量孢子或芽孢的斜面菌株用相应液体培养基（5毫升/支）洗下，以7%接种量分别接于相应的液体发酵培养基中，发酵培养液装量为500 ml锥形瓶中装l00 ml发酵培养液，25±0.5 ℃恒温静止培养12天；细菌30 ℃恒温培养50小时。取各菌株发酵液1 ml测定其含孢量和含菌量，再各取200 ml以6000 r/mim的转速离心，取其上清液后与剩余原发酵液一起保存备用。

1.2.3 各试验菌株的室内杀虫毒力测定

（1）各试验菌株以温室白粉虱若龄幼虫为试虫的室内杀虫毒力测定将制备的各菌株的发酵液及其离心上清液各取l0 ml，用1%吐温水溶液（无菌）稀释10倍后备用。空白对照用1%吐温水溶液（无菌）。从温室选取温室白粉虱危害严重，若龄幼虫比较集中的两年生一品红植株50盆供该实验用。

将带有温室白粉虱若龄幼虫较多的一品红叶片摘下（要求幼虫数在30个以上），记录其上的实际虫头数并将卵用小镊子轻轻剥离，然后用浸湿透的棉花团将叶柄包裹，外用保鲜膜包扎，置于铺有两层干滤纸的12 cm平皿中，叶面向下，叶背向上，将准备好的各菌株稀释发酵液分别用小喷壶喷于备好的试验叶片上，每个备处理叶片分三次喷施，中间间隔1.5个小时，每次喷施药量约5～6 ml，共用20 ml。处理完后将平皿用带微孔的保鲜膜封口，置于温箱中，每日光照10 h、黑暗14 h，25±0.5 ℃恒温培养，每处理药剂做5个重复。24 h后每天用滴管滴入9～10滴无菌水（以保持小环境的适宜湿度确保一品红叶片新鲜和各生防菌萌发浸染）。每种试验药剂包括对照均做5个重复。每天记录死亡虫头数，连续7天。记录累计死亡虫头数，计算校正累计死亡率，并对试验数据用D.B.Duncan新复极差法做统计分析，比较各试验菌株的毒力差异性。

（2）各试验菌株对桃蚜的室内杀虫毒力测定。

将制备的菌株发酵液及其离心上清液各取l0 ml，用1%吐温水溶液（无菌）稀释10倍后备用。空白对照用1%吐温水溶液（无菌）。在桃蚜危害较重的温室中，采集成蚜比较集中的菠菜叶以及新鲜无虫害的嫩叶适量（试虫和饲养用嫩叶的采集量视当日的实验量定，用多少采多少）带回实验室备用。

用软毛笔尖将桃蚜轻轻挑入垫有两层滤纸的直径12 cm的培养皿中，每处理用桃蚜180头以上，将各试验菌株发酵液和对照，各取100 ml分五次（中间间隔30 min）轻轻喷到培养皿中。然后，用毛笔将处理后爬动自如的桃蚜轻轻挑入干净培养皿（直径7.5 crn）的新鲜菠菜嫩叶上，每皿25头，每处理重复5次，然后将各个处理的小培养皿放入直径12 cm的大培养皿中，大培养皿中盛适量无菌水用以保湿，各处理皿口用刺有小孔的保鲜膜覆盖，置22 ℃左右的敞亮房间中饲养。每天观察1次，记录死亡虫头数并及时将若蚜移出，隔天更换大皿中的无菌水（保证小环境的相对无菌和适宜湿度），连续观察7天，记录累计死亡虫头数，计算校正累计死亡率，并对试验数据用D.B.Duncan新复极差法做统计分析，比较各试验菌株的毒力差异性。

1.2.4 各试验菌株发酵液对温室白粉虱的小区防效试验

将制备的菌株发酵液各取200 ml，用1%吐温水溶液稀释10倍备用。空白对照用1%吐温水溶液。

在栽培一品红的温室里，选取温室白粉虱危害比较严重的二年生且正要开花的一品红植株240株，平均分成8个长方形小区，7个为试验药品小区，1个为空白对照小区，各小区之间加保护行，每小区试验植株30株，随机取12株，每株选三片（从植株上、中、下三个位置选取）虫数较多的叶片记录基础虫数并挂牌标记，然后，同时喷施实验药品和清水.从叶片两面喷施，以叶片滴水为度。施药后的前两天遮阴、保湿，并于施药后第3、5、7、15天观察记录标记叶片的活虫数及其有无药害。计算虫校正虫口减退率。并对试验数据用D.B.Duncan新复极差法进行统计分析，比较各试验菌株发酵液对温室白粉虱田间防效的差异显著性。

1.2.5 各试验菌株发酵液对桃蚜的小区防效试验

将寄主换为嫩菠菜，并在其上接种适量桃蚜若虫，10天后分小区进行试验，其余实验方法和数据记录分析同上。

2 结果与分析

2.1 各试验菌株的室内杀虫毒力（表1）

室内毒力测定结果显示，不同种类的生防菌种对温室白粉虱若龄幼虫和桃蚜的杀虫毒力有明显差异。粉虱座壳孢和蜡蚧轮枝菌发酵液对两种害虫的毒力最强，7天后的校正累计死亡率（%）均在90%左右，与其它菌种间存在显著性差异。而球孢白僵菌和苏云会芽孢杆菌发酵液相对较弱，七天后的校正累计死亡率（%）在80%～60%之间，其中苏云金芽孢杆菌对两种害虫的杀虫毒力最弱。

2.2 各试验菌株发酵液对温室白粉虱和桃蚜的小区防治效果

表2和表3的结果显示，七株生防菌株发酵液对温室白粉虱和桃蚜的防治效果基本一致，两株蜡蚧轮枝菌对两种害虫的小区防治效果最强，防治高峰期的校正虫口减退率（%）均可达80%以上，与其它试验菌株之间差异显著。

3 讨论与总结

（1）通过室内毒力测定和室外小区防效试验比较可知，蜡蚧轮枝菌的两个菌株在离体条件下无论是发酵液还是代谢产物对同翅目昆虫温室白粉虱和桃蚜均表现出很强的杀灭毒力，而且能在非寄主作物上定殖而且对目标害虫表现出较好的防治效果，具有很高的开发应用潜力[3]。

（2）粉虱座壳孢对这两种害虫的毒力也很高，但室外防效不很理想，主要原因是菌株F-85本身的抗性较弱以及其代谢产物的毒力不足造成的，只要选对了菌株应该也是这两种害虫比较理想的生防菌。

（3）球孢白僵菌和苏云金芽孢杆菌对同翅目昆虫的毒力较弱，尤其苏云金芽孢杆菌对其基本无效，单独使用价值不高，但从它们的代谢产物毒力分析，与其它生防物质复配扩大其抗虫谱也是一种应用途径。

参考文献

[1] 祝树德.园艺昆虫学[M].北京：中国农业科技出版社，1996：162-165.

[2] 徐汝梅.温室白粉虱对植物的喜好性[J].北京师范大学学报：自然科学版，1994，30（1）：124-130.

[3] 马瑞燕，孔维娜，郝利军.温室白粉虱对几种园艺植物的偏好性[J].昆虫知识，2005，42（3）：301-304.

[4] 花冬梅.冬季温室白粉虱的发生与防治[J].植物医生，2003，16（6）：11-16.