芍药基因组DNA不同提取方法的比较及PCR验证

摘 要：提取基因组DNA是开展芍药分子生物学研究中一项最为基础的工作。本研究通过常规CTAB法和近几年应用较为普遍的试剂盒法，对芍药基因组dna进行了提取，并对2种方法所提取的DNA进行了浓度、程度、琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增比较。结果表明，常规CTAB法提取的DNA浓度较高，为128.08-253.63 ng/ul，但纯度较低，而试剂盒法提取的DNA虽平均浓度较低，为3.51ng/ul，但纯度较高；电泳和PCR结果均表明，试剂盒法提取的DNA能扩增出目的片段，是较好的一种提取方法。

关键词：芍药；DNA；CTAB法；试剂盒法

芍药（Paeonia lactiflora），芍药科芍药属多年生草本植物。原产中国以及亚洲北部，不仅有较高的观赏价值，更有重要的药用价值[1，2]，芍药根中的芍药苷具有扩张血管、镇痛镇静、抗炎、解痉等功效[3，4]。分离芍药相关基因，研究其表达特征，对芍药分子育种工作及抗类风湿作用的分子机制研究具有重要意义[5，6]。提取基因组DNA则是一项最为基础的工作，DNA提取质量的好坏，对后期的研究起着重要的影响。本研究通过常规CTAB法和近几年应用较为普遍的试剂盒法，对芍药基因组DNA进行提取，通过2种方法的比较，以寻求较好的提取方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料芍药嫩叶，采自三门峡牡丹苑。

1.2 方法

1.2.1 CTAB法提取DNA。（1）称取100mg芍药嫩叶，加入液氮内研磨至粉状，加入700μL的CTAB缓冲液，混匀；（2）置于65℃恒温水浴锅中水浴加热30min，其中每隔5min轻轻摇动，使水浴充分；（3）高速离心机中12000rpm离心10min；（4）小心取出，吸取上清液，加入酚-氯仿-异戊醇（25U24U1）700μL，使其充分混匀；（5） 12000rpm离心10min；（6）小心吸取上清，转入新的EP管中，再加入酚-氯仿-异戊醇700μL，振荡混匀；（7）12000rpm离心10min；（8）吸取上清液，转入新的EP管中，加入预冷的无水乙醇，-20℃过夜沉淀；（9）12000rpm离心2min，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，倒置30min，100μLddH2O溶解。

1.2.2 试剂盒提取DNA。（1）称取芍药嫩叶100mg，加入液氮充分研磨至粉状，将研磨好的粉末迅速转移至预先装有700μL预热缓冲液的GP1的离心管中；（2）迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃恒温水浴锅中水浴30min，水浴过程中每隔5min混匀；（3） 30min后加入700μL氯仿充分混匀，12000rpm离心10min；（4）小心将上层水相转移至新的EP管中，加入700μL缓冲液GP2充分混匀；（5）将混匀的液体转移至吸附柱中，12000rpm离心2min，弃掉废液；（6）向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；（7）向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心2min；（8）倒掉废液，将吸附柱放入收集管中，重复清洗步骤，倒掉废液；（8）离心5min；（9）将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；（10）将晾干后的吸附柱放入一个新EP管中，100μLddH2O溶解后离心10min，将溶液收集到离心管中。

1.2.3 DNA的浓度和电泳检测。在紫外分光光度计中测定核酸浓度，取2μL提取的DNA进行电泳检测，1%琼脂糖凝胶，凝胶成像仪中观察结果。

1.2.4 ITS片段的扩增。分别以2种方法所提取DNA样品为模板（CTAB法提取的DNA稀释10倍），进行ITS片段的扩增。ITS引物序列为：上游引物序列5′- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，下游引物序列5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反应体系为20μL，10×buffer2μL，dNTPmix1.6μL，Taq酶0.1μL，Primer各1μL，DNA模板0.5μL，ddH2O13.8μL。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，28个循环， 72℃延伸10min。

2 结果及分析

2.1 2种方法提取后DNA浓度的比较

对2种方法提取的DNA进行浓度检测，结果如表1所示。

由表1可知，利用CTAB法提取的DNA浓度较高，为128.08～253.63 ng/μ，而试剂盒法提取的DNA浓度较低，在0.87～6.14 ng/μ范围内，平均浓度3.51ng/μ。

2.2 电泳检测和PCR扩增结果比较

将2种方法所得的DNA样品2μl点样，检测结果如图1所示，PCR扩增结果如图2所示。

图1结果显示，这2种方法从芍药嫩叶中提取的DNA均没有蛋白污染，条带清晰，但CTAB法提取的DNA中有明显的RNA。从图2可看出，CTAB法所提取的DNA未扩增出目的片段，而试剂盒法的5个样品全部都扩增出了目的片段。

3 小结

DNA纯度是影响后期PCR能否扩增出目的片段很重要的因素。通常情况下，若DNA模板含有杂质，则可能会在PCR反应中产生抑制作用[7-9]。从本试验也可得出，CTAB法提取DNA虽浓度较高，但纯度较低，因此未扩增出目的片段。而试剂盒法提取柽柳基因组DNA的浓度较低，但纯度较高，所以能扩增出目的片段，这和刘艳艳[10]等人的研究结果是一致的。

朱红霞等[11]采用改良的CTAB法对牡丹、芍药的DNA进行了提取，所得DNA的产量和纯度满足AFLP分析，与本试验方法相比，主要是在CTAB裂解液中添加了β-巯基乙醇。β-巯基乙醇是一种抗氧化剂，能有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易被去除，而芍药根和叶片中含有多种次生代谢产物[12]，可能这也是本试验CTAB法中未加β-巯基乙醇等抗氧化剂，从而导致所提取的DN中含有杂质，未能扩增出目的片段的原因。此外，常规CTAB法提取基因组DNA需要在提取后静置沉淀过夜才能进行下一步操作，时间较长，而试剂盒提取方法无需过夜沉淀，操作简单、快捷，是较为理想的提取方法。

参考文献

1 孙丽荣，曹雄，侯凤青，等.芍药苷研究进展[J].中国中药杂志，2008（18）

2 曾宇.当归芍药散抗衰老活性的药效学和药代动力学研究[D].广州中医药大学，2013

3 王巧.芍药质量控制方法与白芍总苷药物动力学研究[D].沈阳药科大学，2005

4 王晓庆，刘建春，田倩倩，等.芍药苷对细胞免疫调节作用的研究进展[J].中华中医药学刊，2016（6）

5 吴彦庆，葛金涛，陶俊.芍药花分生组织决定基因（AP1）克隆、序列分析及其在不同发育时期花瓣中的表达变化规律[J].农业生物技术学报，2015（12）

6 付鹏.几种天然产物活性成分与DNA的相互作用研究[D].南昌大学，2012

7 贾俊忠，田丽萍，位江静，等.快速微量提取番茄DNA及SSR-PCR反应体系的优化[J].北方园艺，2010（8）

8 邹枚伶，夏志强，王文泉.白木香基因组DNA提取与ISSR反应体系的优化[J].中国农学通报，2009（2）

9 黄青青，乙引，魏洪美，等.高质量竹黄菌全基因组DNA的提取方法比较[J].贵州农业科学，2015（12）

10 刘艳艳，东野升金，王想想，等.动物皮张基因组 DNA三种提取方法比较[J].山东农业科学，2015（12）

11 朱红霞，袁涛.一种简便的牡丹、芍药DNA的提取方法[J].山东林业科技，2005（4）

12 金英善，陈曼丽，陶俊.芍药化学成分和药理作用研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志，2013（4）

Comparison of DNA Different Extraction Methods of Paeonia

lactiflora and pcr Verification

Abstract： Extracting genomic DNA from Paeonia lactiflora is one of the most basic work in the research of molecular biology. This study through the conventional CTAB method and Reagent kit， genomic DNA were extracted and concentration of DNA， agarose gel electrophoresis and PCR amplification were compared.. The results showed that DNA concentration by CTAB method was higher， 128.08-253.63 ng/ul and DNA concentration by reagent kit was lower， 3.51ng/ul， but electrophoresis and PCR amplification results showed that DNA extraction kit can amplified fragment， is a better extraction method.

Keywords： Paeonia lactiflora； DNA；CTAB method； Reagent kit