自身抗原PDC?E2融合蛋白在大肠杆菌中的表达及免疫学

【摘要】 目的：用基因工程的方法克隆表达丙酮酸脱氢酶复合体e2（pdc?e2）融合蛋白，以用于人原发性胆汁性肝硬化（pbc）的早期发现和临床诊断。方法：针对pdc?e2的cdna序列设计引物，从正常人的淋巴细胞中提取rna，通过反转录pcr方法扩增得到相应的基因片段，经测定序列验证后插入表达载体pet28a(+)，构建重组表达载体pet28a(+)?pdc?e2，转化大肠杆菌bl21(de3)后诱导表达蛋白质。表达蛋白经sds?page、western blot鉴定。结果：经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明，成功地构建了pdc?e2重组质粒。iptg诱导表达后，获得pdc?e2融合蛋白。经免疫学鉴定，重组抗原片段具有抗线粒体抗体二亚型（ama?m2）的免疫原性。结论：获得pbc特异性靶抗原的多肽片段，为pbc的早期发现和临床诊断提供有力工具。

【关键词】 pbc 自身抗原 pdc?e2 重组融合蛋白

the cdna cloning and expression of autoantigen pdc?e2

zhou ye, yao ding?kang, chen yan, jiang tian?shu, jiang ting?wang, wu chuan?yong, chen bo, zhong ren?qian, deng an?mei.

laboratory diagnostics, changzheng hospital,second military medical university,and clinical immunology center of pla, shanghai 200003, china

［abstract］ objective:to express pdc?e2 recombinant fusion protein in e.coli.methods:the cdna encoding pdc?e2 was obtained by rt?pcr, confirmed by dna sequencing, subcloned indirectionally into the bacterial expression plasmid pet28a(+) and then transformed into e.coil. bl21(de3) to express the recombinant fusion protein induced by iptg.results:the recombinant fusion protein exhibited the antigenicity of ama?m2 by western blot.conclusion:the pdc?e2 recombinant fusion protein could be used for diagnosing pbc.

［key words］ pbc；autoantigen；pdc?e2；recombinant fusion protein

原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，pbc）是一种以肝内中小胆管的非化脓性进行性炎性损伤为特征、最终导致肝硬化和肝衰竭的典型自身免疫性疾病（aid）［1，2］。pbc患者体内可出现多种自身抗体，其中最主要的是抗线粒体抗体（ama）。ama分为m1～m9共9个亚型，而只有m2为pbc特异抗体。ama?m2抗体对pbc检测的敏感性达93%以上，特异性几乎达100%［3］。m2抗体的靶抗原为线粒体上的2?氧酸脱氢酶复合体（2?oadc）的一些组分：丙酮酸脱氢酶复合体e2（pdc?e2）、2?氧酸脱氢酶复合体e2（bcoadc?e2）、2?氧戊二酸脱氢酶复合体e2（ogdc?e2）等。其中pdc?e2是与m2反应的最主要靶抗原，pdc?e2的抗原表位主要位于内酯酰区和部分外酯酰区。我们用基因工程的方法表达pdc?e2融合蛋白，为pbc的早期发现和特异性诊断提供有效手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 血清标本 12例病人血清来源于本院住院病人，经德国euroimmun公司免疫印迹试剂盒测定，m2抗体为阳性；12例正常人血清来源于本院健康体检者。

1.1.2 主要试剂 反转录酶、pcr扩增试剂盒、rna提取试剂盒为qiagen公司产品；各种限制性内切酶、t4dna连接酶购自takara公司；pet?28a(+)质粒及大肠杆菌bl21(de3)购自novagen公司；间接免疫荧光法测定ama试剂盒购自euroinmun公司。

1.1.3 引物 参照人pdc?e2全序列，设计了扩增pdc?e2内酯酰区和部分外酯酰区的引物。pdc?e2正向引物：5′?ttcgccgtgcaaaaattatacactggtatcctg?3′；pdc?e2反向引物：5′?acagctgtgagctctaaatctgttacttcggttg?3′。

1.2 方法

1.2.1 基因克隆操作 用淋巴细胞分离液从健康人外周血中分离单个核细胞，得到的白细胞抽提rna，反转录得到cdna。pet?28a(+)质粒用node ⅰ和ecor ⅰ双酶切后、经t4dna连接酶的作用将pdc?e2的cdna定向插入其中，送上海生工生物工程技术公司测定序列进行鉴定。pcr扩增反应条件为94℃变性1分钟，56℃退火1分钟，72℃延伸1分钟，35个循环后再进行72℃延伸5分钟。

1.2.2 重组质粒的转化和鉴定 将重组质粒用氯化钙转化法导入宿主菌bl21(de3)，加入lb培养液37℃振荡培养45分钟后涂布于lb平板上（含终浓度100 μg/ml卡那霉素）培养过夜。抽提质粒，用1%琼脂糖凝胶电泳观察重组质粒和node ⅰ、ecor ⅰ双酶切后的产物。

1.2.3 重组融合蛋白的收集和纯化 次日挑取转化平皿上的菌落，接种于含卡那霉素的lb培养液中，37℃摇床培养扩增至a600为0.4左右，加入终浓度为0.1 mg/ml的异丙基硫代?β?d?半乳糖苷（iptg），诱导表达4小时，4℃离心收集菌液。将菌液反复冻融4次，经超声破碎仪以300 w 15秒，破碎4次，以上操作在冰浴中进行。而后在4℃、10 000 g离心15分钟，收集沉淀，以含0.5%tritonx?100，10 mmol/l edta的缓冲液洗涤后，用100 μl裂解缓冲液（含0.1 mmol/l pmsf，8 mol/l尿素，10 mmol/l dtt）溶解包涵体，室温放置1小时。再加入900 μl氧化还原缓冲液，最后离心取上清。将上清液流经pbs平衡后的gst亲和层析柱，经20 ml pbs洗涤后，用5 mmol/l还原型谷胱苷肽溶液洗脱，收集洗脱液进行15%十二烷基磺酸钠?聚丙烯酰胺胶电泳（sds?page）分析。

1.2.4 重组蛋白抗原性的鉴定 重组蛋白经sds?page电泳后进行转印，200 ma 40 v 2小时。将转印后的nc膜剪成条带，用含5%bsa的pbs封闭1小时，分别与1∶1 000稀释的人m2阳性血清、正常人血清为一抗反应2小时，充分洗涤后与1∶1 000稀释的hrp标记的兔抗人igg二抗反应2小时，再次洗涤后加入3，3?二氨联苯胺底物及双氧水反应显色。用此反应过的m2阳性血清与pdc?e2工程菌的超声全菌裂解液混匀，4℃过夜，间接免疫荧光法测定ama。

2 结果

2.1 pcr扩增结果 按上述条件扩增出442 bp的片段，经dna测序表明它是pdc?e2基因的精确拷贝。

2.2 表达质粒的构建及鉴定 通过反转录pcr从正常人外周血单个核细胞中扩增相应基因片段，克隆入表达载体pet28a(+)，构建重组表达载体pet28a(+)?pdc?e2。重组载体用限制性内切酶node ⅰ和ecor ⅰ酶切鉴定，序列经测定完全正确，见图1。再将表达pdc?e2融合蛋白的重组体导入大肠杆菌bl21(de3)中。为便于重组蛋白的提纯，我们使用pet28a(+)载体，该载体表达蛋白在n端带6个组氨酸尾巴，用以使ni2+?nta琼脂进一步纯化，组氨酸尾巴一般不影响重组蛋白的抗原性。

图1 重组质粒pet28a(+)/pdc?e2双酶切鉴定电泳图（略）

fig.1 recombinant plasmid pet28a(+)/pdc?e2 after enzyme digestion

note:lane 1.vector pet28a(+);lane 2.recombinant plasmid;m.dna marker dl2000.

图2 pdc?e2融合蛋白的12%sds?page电泳图（略）

fig.2 12%sds?page of pdc?e2 fusion protein

note:lane 1.the lysis of e.coli bl21(de3) containing vector pet28a(+);lane 2.the supernatant of the lysis of e.coli bl21(de3) containing recombinant plasmid;lane 3.the pellet of the lysis of e.coli bl21(de3) containing recombinant plasmid;lane 4.purified pdc?e2 fusion protein;m.protein marker.

图3 用western blot方法鉴定pdc?e2融合蛋白抗原性（略）

fig.3 identification of antigencity of pdc?e2 fusion protein by western blot

note:m.protein marker;lane 1.purified pdc?e2 fusion protein+anti?m2 positive serum;lane 2.purified pdc?e2 fusion protein+normal serum control.

2.3 重组蛋白的诱导表达 重组质粒的工程菌经iptg诱导后进行12%sds?page电泳，在细菌裂解液（上清液）中及包涵体中可见有一条明显的额外蛋白带，相对分子量为18×103，见图2。

2.4 重组蛋白抗原性的鉴定 用western blot方法进行检测，12例m2阳性的病人血清中，抗pdc?e2抗体全部为阳性；12例正常人血清中，抗pdc?e2抗体全部为阴性，见图3。m2阳性的病人血清与表达pdc?e2全菌裂解液混匀过夜后，间接免疫荧光法测定ama为阴性。

3 讨论

据国外研究报道，pbc发病率约为2～24/10万，年发病率为0.4～3.0/10万，且该数值有逐年递长趋势［4］。近年来国内pbc发病率亦不断增加［5］。但尚不清楚这是pbc发病数真正增加还是对该病的认识加强、诊断增加所致。因此，对pbc的早期发现和临床诊断显得尤为重要。ama中只有m2抗体为pbc特异性抗体，其他亚型可见于很多疾病如药物损害、心肌病、类风湿性关节炎及一些感染如结核、梅毒等。间接免疫荧光法无法对ama分型，用于诊断pbc的特异性差。本实验检测的12例m2阳性的病人血清中，全部与pdc?e2融合蛋白反应。m2抗原在细胞内含量较少，传统生物化学方法提纯和制备抗原有很大的局限性，操作复杂，成本高，很难获得纯化的线粒体抗原，影响检测结果。而利用本方法可大量获得所需抗原，用于pbc的免疫学诊断，为pbc的早期发现和临床诊断提供有力工具。

【参考文献】

1 mackay i r,gershwin m e. the nature of autoimmune disease ［j］.semin liver dis,1997;17(1):3?11.

2 kaplan m m. primary biliary cirrhosis ［j］.new engl j med,1996;335(21):1570?1580.

3 persch w,becker h d. frequency and prognosis of gastric stump cancer ［j］. front gastrointest res,1979;5:170?177.

4 metcalf j v,mitchison h c. natural history of early primary biliary cirrhosis ［j］. lancet,1996;348(9039):1399?1405.

5 姚光弼. 重视原发性胆汁性肝硬化的临床研究 ［j］.中华肝脏病杂志，2002;10（5）：