丹酚酸B大鼠在体鼻循环吸收研究

[摘要]该实验研究了丹酚酸B在大鼠的鼻腔吸收特性，建立了HPLC测定灌流液中丹酚酸B的方法，考察了丹酚酸B的不同pH缓冲液对鼻腔的刺激性以及在鼻灌流液中的稳定性，并系统研究了丹酚酸B在体鼻黏膜吸收特性。采用改良的大鼠在体鼻循环模型，通过测定鼻灌流液中总蛋白和乳酸脱氢酶（LDH）的释放量，定量评价pH4.0，5.0，6.0丹酚酸B磷酸缓冲液对大鼠鼻黏膜的刺激性及其在鼻灌流液中的稳定性，比较低、中、高质量浓度（200，400，800mg・L-1）的pH5.0丹酚酸B缓冲液中丹酚酸B大鼠鼻腔吸收特性。结果表明，鼻腔刺激性：pH4.0>pH5.0>pH6.0，pH6.0丹酚酸B缓冲液24h内变化的RSD为3.1%，稳定性差。优选刺激性小，稳定性好的pH5.0丹酚酸B缓冲液，其大鼠鼻灌流试验显示，丹酚酸B的鼻腔吸收符合一级吸收模型，为被动扩散。pH5.0的丹酚酸B缓冲液对鼻腔刺激性小，稳定性良好，在大鼠鼻灌流试验中吸收良好，对丹酚酸B鼻用制剂的开发有一定的意义。

[关键词]丹酚酸B；pH；刺激性；稳定性；大鼠鼻腔吸收

丹酚酸B（salvianolic acid B，SalB），又称丹参酚酸B、丹参酸B、丹酚酸乙，是传统活血化瘀中药丹参的水溶性物质中活性最强的酚酸类化合物。丹酚酸B为3分子丹参素与1分子咖啡酸缩合而成，含量丰富，占丹参干重的2%～8%，约占总酚酸质量的60%。研究表明丹酚酸B有明确的抗脑缺血损伤作用，其作用与抗氧化、清除自由基、神经保护及血脑屏障保护等密切相关。药物经鼻腔给药，由鼻黏膜直接吸收入血，起效迅速，避免血脑屏障阻碍，具有显著的脑靶向性，对于脑中风患者鼻腔给药途径更具优势。因此为了开发丹酚酸B鼻腔给药制剂，本实验采用改良的大鼠在体鼻灌流模型考察丹酚酸B鼻腔吸收情况。

1 材料

Sartorius BT 125D电子分析天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；Techcomp CT15RT高速离心机（上海天美科学仪器厂）；DB-300电子蠕动泵（上海之信仪器有限公司）；FE20实验室oH计（上海梅特勒―托利多仪器有限公司）；LC-20A岛津高效液相色谱仪（四元泵，紫外检测器）。

丹酚酸B对照品（中国食品药品检定研究院，批号11562-201313，以97.0%计）；丹酚酸B提取物（上海源叶生物科技有限公司，批号115939-25-8，以95.0%计）；非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）；乳酸脱氢酶LDH活力定量测定试剂盒（普利莱基因技术有限公司）；磷酸二氢钠（国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团）；其他试剂均为分析纯。

SD大鼠，雄性，体重（250±20）g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号SCXK（京）2012-0001。

2 方法与结果

2.1 丹酚酸B含量测定

2.1.1 色谱条件DiamonsilTM钻石C18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm）；流动相甲醇-乙腈-甲酸-水（30：7：1：62），检测波长286nm，流速1.0mL・min-1，进样量10μL，柱温30℃，丹酚酸B出峰时间14.20min，该条件下，系统适应性良好，见图1。

2.1.2 线性关系考察 精密称取丹酚酸B对照品20.60mg，置于10mL量瓶中，加甲醇溶解并配制成对照品储备液。精密量取一定量的对照品储备液，用甲醇分别稀释为49.96，199.82，399.64，799.28，1498.65mg・L-1对照品溶液。在选定的色谱条件下，测定丹酚酸B的峰面积，以峰面积（4）对质量浓度（C）进行回归，标准曲线方程为A：13251C+15375，r=0.9995，丹酚酸B在49.96～1498.65mg・L-1与峰面积线性关系良好。

2.1.3 精密度考察 精密吸取同一对照品溶液，重复进样6次，峰面积的RSD为0.076%，表明仪器的精密度良好。

2.1.4 稳定性考察 以空白鼻灌流液分别配制低、中、高质量浓度（200，400，800mg・L-1）的丹酚酸B溶液，在4℃下放置不同时间（0，3，6，12，24h）后，15000r・min-1离心15min，吸取上清液进样，测定丹酚酸B的峰面积，其24h内RSD为1.0%，0.71%，0.72%，表明鼻灌流液中丹酚酸B在4℃下24h内稳定。

2.1.5 回收率考察 精密称取丹酚酸B对照品，以空白鼻灌流液分别配制低、中、高质量浓度的丹酚酸B溶液，15000r・min-1离心15min，吸取上清液进样测定，计算测得含量，与理论值进行比较计算回收率，结果显示回收率在95.0%～105%，说明该方法准确，结果见表1。

2.2 大鼠鼻腔循环灌流试验

2.2.1 动物模型的准备 体重（250±20）g，SD雄性大鼠，饲养1～3d，待其充分适应环境后，正常饮水，禁食12h。大鼠腹腔注射20%乌拉坦（1.0g・kg-1）麻醉，仰卧固定于鼠板上，于颈部切口暴露气管和食管。取聚乙烯管2支，一支插入气管，另一支的一端插入食管，直至鼻腔底部。用胶黏剂将鼻腔与口腔的鼻腭通道封闭，以防药液流入口腔，管子的另一端与蠕动泵硅胶管相接后，硅胶管另一端插入药液底部，启动蠕动泵使药液循环。

2.2.2 鼻腔灌流循环试验 循环液体积流量设为2.5mL・min-1。首先以生理盐水10mL循环10min，测定循环前后的生理盐水体积，若体积变化小于0.1mL则整个环路密封性良好，无漏液情况。排尽生理盐水后，取5mL药液置5mL量筒中，37℃水浴恒温，将蠕动泵进液管插入量筒底部，启动蠕动泵，待大鼠鼻中药液滴出时开始计时，设为0时，于0，10，20，30，45，60，90，120min读取量筒中剩余药液体积V后取样0.25mL，补加循环药液0.25mL，样品15000r・min-1高速离心15min，吸取上清液0.15mL，以HPLC进行测定各时间剩余药物浓度Cn。其中循环死体积为VD：=（5-V0）。剩余药量Qn采用体积校正法来计算。

式中Qn为第n个时间点的剩余药量（μg）；（Vn+VD）为第n个时间点循环液的实际体积（mL）；Cn为第n个取样点测得的药物质量浓度（mg・L-1）；C为补加的循环药液（母液）的质量浓度（mg・L-1）。

通过不同时间的剩余药量Qn，计算各时间点剩余药量百分率X取对数后与相应时间t进行回归，回归直线的斜率即为吸收速度常数K，K的大小可反映药物的鼻腔吸收情况。

X=Qn/Q0

lnX=-Kt

文献报道鼻循环灌流过程中鼻腔对水分的分泌和重吸收可忽略不计。但根据试验中的实际情况，大鼠在2h左右一般会吸收1mL左右的吸收液，液体体积的变化对药物吸收量的计算影响极大，经过多次预实验确定以体积法计算各时间Qn。

2.2.3 蠕动泵管路的物理吸附情况考察 采用循环装置，将以生理盐水配制的质量浓度为203.3mg・L-1丹酚酸B溶液10mL置于量筒中，37℃恒温水浴，蠕动泵硅胶管插入药液中，于体外空循环，在0，0.25，0.5，3h取样测定，RSD0.98%。说明3h内丹酚酸B在循环管路中基本不吸附。

2.3 丹酚酸B生理盐水溶液质量浓度对丹酚酸B鼻腔吸收的影响

精密称取丹酚酸B提取物适量，配制成质量浓度为200，400，800mg・L-1的丹酚酸B生理盐水溶液。按2.2.2项下进行各质量浓度丹酚酸B大鼠鼻腔灌流试验，结果见图2，表2。从图2中可以明显看出，中、高浓度组lnX～t曲线的线性关系较差，第2个时间点10min处有明显弯曲，推测该现象与丹酚酸B本身为弱酸性成分有关，测定低、中、高（200，400，800mg・L-1）组丹酚酸B生理盐水溶液的oH分别为3.89，3.03，2.84。大鼠鼻黏液oH为5.5-6.5，中高浓度组丹酚酸B酸性太大，对大鼠鼻黏膜产生了强烈刺激，导致了丹酚酸BlnX～t曲线弯曲。因此须优选适宜的oH，使其对鼻黏膜刺激性小，且在鼻腔分泌液中稳定。

2.4 不同pH丹酚酸B磷酸缓冲液的鼻黏膜刺激性研究

已知丹酚酸B在pH2.5～5.0时最稳定，结合鼻黏液平均pH为5.5～6.5，考察pH4.0，5.0，6.0时丹酚酸B对鼻黏膜的刺激性。配制0.1mol・L-1的NaH2PO4溶液，分别用H3PO4和10%NaOH溶液调节pH为4.0，5.0，6.0。并配制上述各缓冲液的400mg・L-1丹酚酸B溶液，以2.5mol・L-1Na0H微调pH，使丹酚酸B缓冲液最终pH为4.0，5.0，6.0。

鼻黏膜受损时会释放蛋白质，细胞内的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）也会大量释放，采用循环灌流法收集不同时间所得灌流液，以非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒测定其中蛋白总量，以乳酸脱氢酶LDH活力定量测定试剂盒测定其中LDH活力，以此判断不同pH的丹酚酸B磷酸缓冲液对鼻黏膜的刺激性。按2.2.2项下进行各pH的丹酚酸B磷酸缓冲液大鼠鼻腔灌流试验，结果见图3，4。

从图3，4中可以明显看出，pH4丹酚酸B缓冲液的蛋白分泌量及LDH活力最大，pH5丹酚酸B缓冲液次之，pH6丹酚酸B缓冲液再次之，生理盐水组的蛋白分泌量及LDH活力最小，因此鼻黏膜刺激性：pH4>pH5>pH6>生理盐水。

2.5 不同pH丹酚酸B缓冲液在大鼠鼻灌流液中的稳定性研究

丹酚酸B溶液的pH对丹酚酸B稳定性有很大影响，因此必须考察pH4.0，5.0，6.0时丹酚酸B缓冲液在大鼠鼻灌流液中的稳定性。

按照2.2.2项下方法，以生理盐水为循环液，将蠕动泵进液口接一根聚乙烯管，插入盛有10mL生理盐水的容器中，蠕动泵出液口连接进入大鼠鼻腔的聚乙烯管，开启蠕动泵使生理盐水通过鼻腔，循环2h后，转移后定容到10mL，即得大鼠鼻腔分泌液。

精密称取丹酚酸B提取物适量，置于25mL量瓶中，加入5mL大鼠鼻腔分泌液，再加入各pH的磷酸缓冲液定容，以2.5mol・L-1Na0H微调pH，分别配制成pH4.0，5.0，6.0的400mg・L-1丹酚酸B溶液。置37℃水浴中孵育震荡，分别于0，2，4，6，12，24h取样，15000r・min-1离心15min，吸取上清液进样，测定丹酚酸B峰面积，计算不同时间的RSD。PH4.0，5.0，6.0的丹酚酸B缓冲液在大鼠鼻腔分泌液中峰面积变化的RSD分别为0.36%，0.58%，3.1%，说明pH4.0，5.0的丹酚酸B缓冲液在大鼠鼻腔分泌液中24h内稳定性良好，而pH6.0的丹酚酸B缓冲液在大鼠鼻腔分泌液中24h内不稳定。

为丹酚酸B溶液优选的适宜的pH，既要满足对鼻黏膜刺激性小，又要稳定性良好。结合2.4项下不同pH丹酚酸B缓冲液的鼻黏膜刺激性试验，pH6.0时刺激性最小，但稳定性差，不满足要求。pH5.0的丹酚酸B缓冲液刺激性较小，且在大鼠鼻腔分泌液中24h内稳定性良好，所以选定pH5.0的丹酚酸B缓冲液进行下一步的大鼠鼻腔灌流试验。

2.6 pH5.0丹酚酸B缓冲液质量浓度对丹酚酸B鼻腔吸收的影响

精密称取丹酚酸B提取物适量，加pH5.0的磷酸缓冲液溶解配制成质量浓度为200，400，800mg・L-1的丹酚酸B缓冲液，以2.5mol・L-1Na0H微调pH，使丹酚酸B缓冲液最终pH为5.0。

按2.2.2项下进行各质量浓度丹酚酸B大鼠鼻腔灌流试验，结果见图5，表3。对低、中、高（200，400，800mg・L-1）3组数据进行方差分析，无显著性差异。采用t检验进行差异检验，发现不同质量浓度的丹酚酸B大鼠鼻腔K无显著性差异。在质量浓度为200～800mg・L-1的pH5.0丹酚酸B缓冲液中，丹酚酸B的吸收符合一级吸收模型，推测吸收为基于质量浓度梯度的被动扩散。

3 讨论

丹酚酸B是丹参水溶性物质中活性最强的成分，也是研究较多的丹参酚酸之一。丹酚酸B可以改善大鼠急性脑缺血再灌注所致的细胞损伤，具有抗氧化、脑保护、改善学习记忆力等作用。鼻腔给药治疗脑部疾病具有明显的优势，为了开发丹酚酸B鼻用给药制剂，需要先确定给药后药物的吸收特点，因此本实验进行了丹酚酸B的大鼠在体鼻循环吸收研究。实验结果表明丹酚酸B的吸收符合一级吸收模型，吸收机制为被动扩散。

本实验初始未考虑。H对丹酚酸B鼻腔灌流实验的影响，直接以生理盐水配制了低、中、高质量浓度的丹酚酸B溶液，结果lnX～t曲线的第2个时间点（10min）吸收率明显偏高，这可能是由于开始灌流后，pH3左右的丹酚酸B溶液进入鼻腔，对鼻黏膜产生强烈的刺激性，一定程度破坏了鼻黏膜，导致第2个时间点（10min）丹酚酸B的吸收增加。对比丹酚酸B生理盐水溶液和pH5.0丹酚酸B缓冲液的鼻腔吸收曲线，即图2和图5，在校正丹酚酸B溶液pH为5.0后，丹酚酸B的鼻腔吸收曲线线性明显改善。均达到0.99，验证了以上猜想。因此pH对于丹酚酸B鼻腔灌流实验有很重要的影响。有的文献并未考虑药物pH对鼻灌流实验的影响，直接以生理盐水溶解药物作为灌流液，本实验证明了对于像丹酚酸B这样的弱酸性或者酸性药物，进行鼻灌流试验或者鼻腔给药时，校正其pH，考察其对鼻黏膜的刺激性是十分重要的一步。

对比丹酚酸B生理盐水溶液和pH5.0丹酚酸B缓冲液的吸收速率常数K，即表2，3，未校正oH的丹酚酸B生理盐水溶液的K，无论低、中、高组均大于pH5.0丹酚酸B缓冲液。该现象可能是由2个因素造成的：一是pH3左右的丹酚酸B生理盐水溶液刺激性强，一定程度损伤了大鼠鼻黏膜，造成了丹酚酸B的吸收增大；二是丹酚酸的pKa1为3.35，pH5.0丹酚酸B缓冲液中的丹酚酸B大部分以离子状态存在，透过变得较为困难，鼻黏膜吸收较少。pH5.0丹酚酸B缓冲液中丹酚酸B虽然鼻腔吸收较少，但是对鼻黏膜刺激性小，稳定性良好，对丹酚酸B鼻用制剂的开发具有一定的意义。

测定特定蛋白和酶的释放量等生化指标，如总蛋白、乳酸脱氢酶（LDH）、5_核昔酸酶等，可定量评价药物对鼻黏膜的刺激性，简便可靠。本实验通过测定灌流液中总蛋白和乳酸脱氢酶（LDH）的释放量，评价不同DH的丹酚酸B缓冲液对鼻黏膜的刺激性。在测定丹酚酸B溶液中的总蛋白时，因丹酚酸B本身结构特点和强还原性，常用的考马斯亮蓝G-250染色法和BCA法均有阴性干扰，因此本实验选用了非干扰型蛋白质浓度测定试剂盒，在样品中加入沉淀试剂，离心沉淀蛋白，去除上清，除掉干扰物质丹酚酸B，再将沉淀的蛋白复溶，加生色剂，产生特定的吸收波长，测定其吸光度，该方法无阴性干扰，可用于丹酚酸B溶液中蛋白质的含量测定。