冈杂棉 8号SSR数字指纹图谱的构建

摘要：利用32对SSR引物对冈杂棉8号及其亲本进行多态性检测，共有13对引物在2个亲本间具有多态性，这些引物在两亲本间扩增出大小不同的带，且这些标记位点在F1中均表现为杂合带，为共显性标记。将这13对引物在亲本和杂交种间扩增检测得到的01带型数据转换成十进制数据，构建了冈杂棉8号及其亲本的数字指纹图谱，为杂交种的真伪鉴定和纯度检测提供了方法。采用多对引物构建的杂交棉数字指纹图谱，能为冈杂棉8号的真伪鉴定、纯度检测及亲本提纯等工作提供更加准确的技术指导。

关键词：冈杂棉8号；ssr；数字指纹图谱

中图分类号：S562∶Q789 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）09-2057-04

棉花是常异花授粉作物，在良种繁育过程中常常出现品种退化现象，在人工制种过程中，因母本去雄不彻底或漏去雄而形成的自交铃会严重影响杂交种纯度，种子的混杂不仅影响产量，也会导致品质的不一致，因此高纯度的杂交种是棉花获得高产优质的基本保障[1]。快速、准确而高效的纯度鉴定对杂交棉品种的推广应用具有重要的现实意义。常规的纯度鉴定多是利用形态性状或（和）生理生化性状等，受环境影响大，并且鉴定周期长[2]。DNA分子标记技术直接检测基因组DNA之间的多态性，不受栽培条件、生态环境和生长发育阶段等因素的影响，并且可以在全生育期的任何阶段进行检测，包括种子也可以进行检测。SSR（Simple sequence repeat）标记具有数量丰富，分布于整个基因组，等位变异高，多数共显性遗传，重复性好，特异性强，结果稳定可靠等优点，在遗传作图、QTL定位、遗传多样性、关联作图及品种鉴定方面得到了广泛应用[3]。分子指纹图谱的研究工作在水稻[4]、玉米[5]、小麦[6]等多个作物上得到应用。

在棉花上，经前人鉴定，在众多的SSR引物中选择了多态性、稳定性、重复性等综合特性好的引物作为棉花品种资源鉴定和分子指纹分析的核心引物[7，8]。殷剑美等[9]筛选了217对SSR引物，共有12对引物在两个亲本间具有多态性，构建杂交棉苏杂118的SSR指纹图谱，为该品种的真伪鉴定和纯度检测提供了分子学依据。潘兆娥等[10]利用25对核心引物对中棉所48及其亲本进行多态性检测，有14对引物在两亲本间扩增出大小不同的带，且这些标记位点在F1中均表现为杂合带，为共显性标记；构建了中棉所48的数字指纹图谱，为杂交种的真伪鉴定和纯度检测提供了方法。

冈杂棉8号是湖北省黄冈市农业科学院、湖北省农业科技创新中心鄂东南综合试验站用冈173-6为母本、冈19-28为父本配组选育而成，2008年3月通过湖北省农作物品种审定委员会审定（审定编号鄂审棉2008005），因丰产稳产性好，深受广大棉农的喜爱[11-13]。为建立冈杂棉8号快速鉴定技术，利用SSR分子标记技术，根据已筛选和鉴定出的核心引物，构建了冈杂棉8号及其亲本的DNA指纹图谱，为该品种的权益保护、真伪鉴别、杂种纯度鉴定和亲本提纯等提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

杂交棉品种冈杂棉8号、母本冈173-6、父本冈19-28及用于纯度鉴定的杂交种F1均由湖北盛丰科技有限公司提供。

1.2 引物序列信息

根据冈杂棉8号亲本来源，参考前人在构建棉花指纹图谱及品种鉴定上使用的核心引物，选择了32对SSR核心引物用于DNA指纹图谱的构建[7]，SSR引物序列来源于Cotton CMD数据库[14]，引物由上海博亚生物技术有限公司合成，引物具体信息见表1。

1.3 棉花基因组DNA的提取

田间取棉花幼嫩叶片，采用CTAB法提取所有试验材料的总DNA，棉花叶片基因组总DNA的分离和纯化参考Paterson等[15]的方法，提取的DNA用TE（Tris-EDTA ddH2O）溶解，利用赛默飞公司Thermo Scientific NanoDrop 2000超微量分光光度计对DNA样品进行质量测定及浓度定量，-20 ℃保存备用。

1.4 PCR反应体系

将样品DNA溶液用灭菌双蒸水稀释至10 ng/μL。PCR应体系为：模板3 μL，正向引物（2U/mol） 2.5 ？滋L，反向引物（2 U/mol）2.5 ？滋L，dNTPs（10 mol/L）0.5 ？滋L，10×Buffer 2.5 ？滋L ，Taq酶0.5 U，补充ddH2O至25 ？滋L。扩增仪器型号为Bio-Rad Mycycler，反应程序为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性50 s，56℃退火45 s ，72 ℃延伸1 min， 34次循环；72 ℃延伸5 min。

1.5 PCR 产物的检测

SSR扩增产物用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶检测。电泳槽为北京市六一仪器厂DYCZ-30型电泳槽，在15W恒功率电泳180 min左右，缓冲液为1×TBE，点样量为每孔3.5 μL。电泳后的银染法步骤：固定56 min；渗透12 min左右；ddH2O洗30 s；加入显色液，轻摇至DNA条带显出为止；ddH2O洗 1～2 次；加入终止液终止反应；统计带型并照相。

1.6 数据统计与SSR分析

标记的数据记录根据电泳结果采用0、1系统描述条带的相对位置，条带清晰的记为1，缺失的则记为0，依据分子质量从小到大的顺序读带，不具多态性的条带不予统计。然后，将每对引物在品种间扩增得到的01（二进制）数据转换成十进制数据，以位数最多的十进制数为标准，位数不够的在数字前面加0补成相同的数字位数，用该十进制数代表每个引物的扩增结果，用多个引物的十进制数据组合成数字串作为该材料的数字指纹。

2 结果与分析

2.1 冈杂棉8号父母本的多态性检测

利用32对核心引物对冈杂棉8号及其亲本等3个材料进行分子多态性检测，其中有13对引物在两亲本间扩增出不同带型，说明这些引物在两个亲本间具有多态性。这13对引物分别为NAU1102、MUCS101、HAU1300、MGHES-44、NAU934、MON_CGR6410、Gh277、NAU1200、NAU1362、MON_SHIN-0376、NAU859、HAU2026、NAU1233，由亲本间带型可知这13对引物的标记位点在F1中均表现为杂合带型（图1，以引物MUCS101为例），为共显性标记，这些标记位点可清楚地区分父本母本及F1，因此可以直接用于冈杂棉8号杂交种的纯度鉴定。

2.2 杂交种及其亲本SSR数字指纹图谱的构建

利用13对共显性引物对冈杂棉8号及其亲本材料进行基因型分析，获得的条带数据为01带型记录，随后将二进制（01）数据转换为十进制数据（表2）。如NAU1102在母本中的读带结果为011，将此二进制数转换为十进制数为3，在父本中的读带结果为101，将此二进制数转换为十进制数为5。用这13对引物组成的十进制数字串分别代表亲本及其杂种的数字指纹代码，这些数字代码分别对应于相应的SSR引物编码，可以作为冈杂棉8号及其亲本的分子身份证，为真伪杂交种的辨别及亲本的提纯复壮等工作提供指导。

2.3 杂交种纯度鉴定

通过多态性检验，获得了13对共显性标记，理论上其中任何一对都可用于冈杂棉8号杂交种的纯度鉴定。对制种基地某农户提供的样品进行随机抽样，抽取样品种子100粒，采用引物MUCS101对样本和亲本进行了纯度鉴定，从扩增的带型来看，100粒种子中与父本带型相同的有5株，1株带型与母本相同，其余的与F1带型相同，根据该引物检测结果，在样品中F1带型的检出率为94%。

3 结论与讨论

杂种优势利用是棉花育种的有效手段之一，近年来转基因抗虫杂交棉在生产上得到了广泛的应用[16]。随着产量水平的提高，育种单位的增多，生产上应用的杂交种也不断增多，但是由于棉花遗传基础狭窄，杂交种种间同质性程度高，种间差异越来越小，并且形态差异多数受环境影响，品种的纯度检测和真实性鉴定都遇到了难题[17]。

SSR标记是目前广泛应用的分子标记技术之一，一般呈共显性遗传，具有重复性好，多态性丰富等特点，用于棉花杂交种纯度鉴定具有很大的优越性。

目前棉花杂交种的制种一般都是采取人工去雄的方法，人工去雄技术是否规范直接影响杂交种种子的纯度，制种过程中漏去雄、去雄不彻底或母本花药粘着苞叶使柱头造成串粉等情况常常导致母本自交成铃，同时父母本混杂种植制种，在收获过程中也可能引起父本混杂[18]。杂交种的纯度不仅关系到经营企业的声誉和利益，还关系到棉花产量，影响棉农收益。

由于棉种间形态差异较小，田间鉴定准确度较差，一般仅能根据抗虫基因的后代分离进行鉴定[19]，因此构建分子指纹图谱技术将简化鉴定流程，缩短鉴定时间，有利于及时快速了解种子的纯度及真实性情况。

本研究利用32对核心引物对冈杂棉8号及其亲本进行多态性检测，共有13对引物在2个亲本间具有多态性，这些引物在两亲本间扩增出大小不同的带，且这些标记位点在F1中均表现为杂合带，为共显性标记。将这13对引物在不同材料间扩增得到的01（二进制）数据转换成十进制数据，构建了冈杂棉8号的数字指纹图谱，为杂交种的真伪鉴定和纯度检测提供参考。

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