体外光化学疗法治疗移植物抗宿主病的研究进展

[摘要] 移植物抗宿主病（GvHD）是异基因干细胞移植后的一种常见且很严重的并发症。体外光化学疗法（ECP）是一种免疫调节疗法。作者综述了ECP诱导免疫耐受从而治疗GvHD的可能的作用机制，包括诱导淋巴细胞、单核细胞和单核细胞衍生的树突状细胞的凋亡,调节细胞因子分泌和诱导调节性T细胞增殖。目前在国外，ECP已经被广泛应用在急性GvHD（aGvHD）和慢性GvHD（cGvHD）的治疗中,无论在儿童或者成人患者，都取得了较好的治疗效果，是一项有效的辅助治疗方案。ECP为对激素耐药和对激素依赖的aGvHD和cGvHD患者提供了一种较好的治疗选择，而且ECP作为辅助治疗可以减少类固醇的用量，明显减少患者的副反应。

［关键词］ 移植物抗宿主病； 体外光化学疗法； 文献综述

［中图分类号］ R457.2 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1671-7562（2011）01-0108-05

doi:10.3969/j.issn.1671-7562.2011.01.省略

［通信作者］ 丁家华 E-mail： jiahuading@medmail.省略

体外光化学疗法（extracorporeal photochemotherapy， ECP）是由Edelson等研究发展起来的一种新的治疗方法［1］，在一些自身免疫病和T-cell介导的疾病包括硬皮病、皮肤T细胞淋巴瘤（CTCL）、严重的全身特应性皮炎及糜烂性口腔扁平苔藓中有明确的疗效。ECP也被应用于诱导实体器官移植和造血干细胞移植后的免疫耐受［2-4］。ECP的实施过程首先是抽取病人外周血分离白细胞，提取的白细胞经长波紫外线（UVA）照射后，将大约240 ml白细胞富集的血液与300 ml的病人血浆及5 ml的液态8-MOP混合，然后将试管中提取的血沉棕黄层置于1 mm的胶片上，在无菌暗盒里照射UVA 180 min，使白细胞的平均暴露剂量为2 J・cm-2，最后将血沉棕黄层回输病人体内［5-6］。病人对ECP有较好的耐受性，至今关于其副作用的报道很少。

1 ECP诱导免疫耐受从而治疗移植物抗宿主病（GvHD）的可能机制

1.1 ECP诱导免疫细胞凋亡

在ECP的实施过程中，有大约5×108的凋亡细胞由静脉重新输注入患者的体内，所以凋亡细胞是否在ECP诱导免疫耐受的过程中起作用，这个问题很值得研究［7-8］。有学者证明ECP治疗GvHD的机制主要是通过激活Fas/FasL系统和Bcl-2蛋白家族使大量淋巴细胞凋亡［9］。长期以来，单核细胞似乎并不被诱导凋亡。但Rao等［10］用ECP和X线照射在体外处理单核细胞和不成熟的树突状细胞（DC），然后观察这两种细胞的分化和生存能力的变化。结果EPC诱导了淋巴细胞、单核细胞和不成熟DC的凋亡，对比之下，X线照射只诱导了淋巴细胞的凋亡。在试验期间，少数残存的ECP处理过的单核细胞表现出分化为不成熟DC的能力下降，而且经EPC处理后不成熟的DC失去了在脂多糖刺激下分化成熟的能力。Setterblad等［11］证明，GvHD患者的单核细胞对HLA-DR介导的凋亡是敏感的，ECP治疗不但提高了自发性凋亡的敏感性，而且提高了HLA-DR介导的凋亡的敏感性。

1.2 ECP和单核细胞衍生的DC

单核细胞在体外一定条件下可以衍生为一种不成熟的DC细胞，这种DC细胞表面表达HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ类分子，但是协同刺激信号分子如CD80、CD-86、CD40表达较少。然后当这种细胞遇到炎症因子或感染信号如TNF-α和LPS时，它会分化为成熟的DC细胞。Holtick等［12］在体外用8-MOP/UVA处理单核细胞衍生的DC（mo-DCs）然后分析其表面分子的表达、凋亡标记、细胞内吞作用、迁移和免疫激活的能力。加入CD40L的刺激以检测mo-DC的表型和细胞因子的分泌。用补骨脂素与UVA（简称PUVA）处理过的mo-DCs刺激未致敏的T细胞以检测Th1/Th2细胞因子的分泌和伴随的趋化因子受体。结果显示，无论在体外的PUVA还是在体内的ECP，DCs都有凋亡。在体外，凋亡在不成熟的mo-DC分化成熟之前就发生了。PUVA处理过的不成熟的mo-DC的迁移和免疫激活能力提高了，然而其表面缺乏CD40分子，不能与T细胞表面CD40L结合，而且mo-DC不再分泌IL-12。PUVA处理mo-DC后，分泌IL-4、IL-10、和IL-13增加，IFN-γ减少而且Th2相关的趋化因子受体CCR4和CCR10也有表达，所以未致敏的淋巴细胞倾向于转化为Th2。向Th2转化的过程可以被外源的IL-12逆转。从以上可以看出ECP的免疫调节机制包括直接调节DC的功能和DC的凋亡。Legitimo等［13］在体外将PUVA处理过的单核细胞与未经处理的单核细胞在一起共同培养，但10%的PUVA处理过的细胞并不能诱导单核细胞分化为不成熟的DCs。加入一些细胞因子到培养系统后，他们获得了有相当高吞噬活性的不成熟DCs，而且DCs的表面抗原HLA-DR的表达也增加。这些DCs有被脂多糖激活的能力但诱导T细胞增殖的能力下降。

1.3 ECP和调节性T细胞

CD4（+）CD25（+）的细胞在自体免疫调节中起着重要作用，因此人们将此群细胞定义为调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）。Gatza等［14］建立了一个与临床相关的小鼠模型，经ECP处理以检测其在免疫反应过程中的效应。他们证明小鼠的调节性T细胞增加了且没有经过ECP处理过的效应性淋巴细胞的数量通过间接作用减少了，从而ECP通过再输注处理过的细胞而逆转小鼠的GvHD。Bladon等［15］选择了8例接受ECP治疗的病人作为实验组，8例与实验组年龄、性别相对应的未接受过ECP治疗的病人作为对照组，3个月后评估他们的淋巴细胞总数和CD4（+）T细胞及CD8（+）T细胞的数量。同时评估CD4（+）CD25（+）、CD4（+）CD25（+）CD69（-）、CD4（+）CD25（+）CD152（+）和CD4（+）CD25（+）FOXP3（+）等调节性T细胞的数量。3个月后淋巴细胞总数和CD4（+）T细胞、CD8（+）T细胞数量及调节性T细胞数量都增加了，但是调节性T细胞占CD4（+）T细胞的比例并无提高。所以ECP诱导调节性T细胞增加并不具有特异性，因为淋巴细胞总数和CD4（+）T细胞的数量都增加了。而George等［16］却在小鼠器官移植模型上证明，移植后经EPC治疗过的小鼠的FoxP3（+）CD4（+）CD25（+）T细胞的比例比未经EPC处理的小鼠高。Rubegni等［17］也在慢性GvHD（cGvHD）患者身上得到结论，经ECP治疗12个月后患者的CD4（+）CD25（+）T细胞的比例比未经治疗的患者高。还有研究［18］在GvHD患者身上发现，ECP治疗伴随着血液中循环的调节性T细胞的增加。可以推测，CD4（+）CD25（+）T细胞在ECP的免疫调节效应上起重要作用。

1.4 ECP和细胞因子

调节各种细胞因子的分泌是ECP的免疫调节机制之一。DC不但可以捕获并递呈凋亡细胞的抗原，而且会引起一些细胞因子分泌的变化。虽然在实体器官移植中已经有证据显示TGF-β在凋亡细胞诱导的免疫耐受中起重要作用，但是在GvHD中还没有直接的证据显示TGF-β与凋亡的联系［7-8］。Bladon等［19］分别分离出ECP处理前后GvHD病人血中的淋巴细胞，并用Annexin Ⅴ检测淋巴细胞磷脂酰丝氨酸的外化。20 h后再抽取病人外周血提取单核细胞，分别放入上述两种淋巴细胞中，再分别加入脂多糖和布雷菲德菌素A。检测发现，经ECP处理后单核细胞产生的IL-1α和IL-6减少，但与Annexin Ⅴ阳性的淋巴细胞水平无关。说明ECP处理过的淋巴细胞能减少脂多糖激活的单核细胞产生一些致炎因子，但是这并不依赖于淋巴细胞磷脂酰丝氨酸的外化。di Renzo等［20］证明ECP的治疗效应是由再输注大量的自体凋亡细胞引起的，它们下调了DCs的共刺激信号分子，使其不能提供激活T细胞的第二信号，而且上调了免疫抑制细胞因子IL-10。

2 ECP与急性GvHD（aGvHD）

aGvHD是造血干细胞移植后发病率和死亡率较高的疾病，即使已进行了足够的移植后免疫抑制治疗，受者接受HLA相匹配供者的造血干细胞仍有30%～60%的发病率［21］。皮质激素作为aGvHD的一线治疗方案仍不尽如人意，持续的完全缓解率只有35%，1年生存率只有53%［22］。ECP治疗很可能为aGVHD患者提供了一项更好的选择，可改善移植后患者的生存质量。有研究［23］报道，给41例儿童做了无亲缘关系的骨髓移植，其中31例移植后发生了aGvHD，16例对激素治疗敏感，另外15例因为对激素抵抗、依赖而用ECP治疗。在移植后100 d内，ECP治疗的aGvHD儿童的完全缓解率（所有指标正常）达73%，而用激素治疗的aGvHD儿童的完全缓解率只有56%；2年的总生存率和生存患者中病情无进展的人数比例在激素治疗组分别为57%和67%，而在ECP治疗组为85%和87%。故有学者提出用ECP治疗激素耐药和对激素依赖的患者，将ECP作为二线治疗方案（用药包括类固醇2 mg・kg-1・d-1和CsA）对21例激素耐药的患者实施了治疗，使患者的生存率得到了提高。在第二阶段研究中，对38例激素耐药和对激素依赖的患者，每隔一星期进行连续2 d的加强ECP治疗，当ECP达到最大效应时立即停止［24］。第二阶段研究中患者在ECP前进行了15 d的类固醇治疗，相对于前一阶段21 d的类固醇预治疗时间缩短了。大约在40 d的ECP治疗后，患者达到了最大反应；大约在55 d ECP治疗后停止使用类固醇药，而且患者病情无复发迹象。这两项研究的统计数据表明，Ⅱ级aGvHD患者的完全缓解率达到86%，Ⅲ级和Ⅳ级aGvHD患者的完全缓解率分别达到55%和30%。82%的有皮肤累及患者、61%的有肝脏和肠道累及患者症状完全消退。在第二阶段的研究中，累及肠道患者的缓解率比第一阶段高（73% vs 25%），Ⅳ级aGvHD患者的缓解率也高（60% vs 12%）。在停止ECP治疗大约46个月后，28例生存，22例（79%）未出现cGvHD，3例出现局部的cGvHD，3例出现广泛的cGvHD ［25-26］。这些研究结果都显示，对激素耐药和依赖的患者来说，ECP是一项有效的辅助治疗方案。加强的ECP可使50%以上的aGvHD患者获得长期稳定的疗效。早期进行ECP可以提高那些Ⅳ级aGvHD和有肝脏及肠道累及的严重的aGvHD患者的缓解率。ECP作为辅助治疗可以减少类固醇的用量，明显减少副作用［27］。Perotti等［28］研究了ECP用于GvHD患儿的治疗反应及生存率的影响因素，结果显示，患儿在ECP治疗后的30 d内减少激素的用量可以提高生存率。

3 ECP与cGvHD

cGvHD是同种异体造血干细胞移植后晚期发生的一种主要的并发症，大约有50%的患者会在移植后3～24个月内发生cGvHD。由于老年受者增多、外周血干细胞作为移植来源、使用不匹配的骨髓及造血干细胞移植后输注供者的淋巴细胞防止恶性肿瘤的复发等，cGvHD的发生呈上升趋势。cGvHD的症状涉及全身各系统，包括皮肤、眼睛、口腔、肝脏、胃肠道、筋膜和免疫系统。cGvHD是患者移植后的常见并发症，严重影响了移植患者的生活质量［29］。

Greinix等［25］回顾了ECP治疗cGvHD的临床效果，试点研究了15例有广泛cGvHD的患者，每隔2～4周进行1次ECP治疗直至达到治疗的最大效应。结果15例有皮肤累及的病人中，12例达到了完全缓解，10例有肝脏累及者7例达到了完全缓解，11例有口腔黏膜累及者11例都达到完全缓解。后来在维也纳进行了一项较大型的包括47例病人的ECP治疗cGvHD的研究，29例病人的疾病处于静止状态，14例处于进展期，4例是新发生的cGvHD，他们的cGvHD都是在造血干细胞移植后8个月左右发生的。结果，68%累及皮肤、81%累及口腔、68%累及肝病、28%累及视觉、11%累及关节的所有患者都达到了完全缓解［25］。

近年，ECP已经成为维也纳大学医疗部治疗激素耐药和对激素依赖的患有广泛的cGvHD患者的标准疗法。标准疗法为CsA或他克莫司加上类固醇（1 mg・kg-1）再加上每2个星期的连续2 d的ECP治疗。当cGvHD症状有所缓解时，就改为每4～6个星期做1次ECP治疗。ECP不会导致广泛的免疫抑制，并有较好的安全性［27］。在意大利2005年儿童血浆置换疗法的统计报告中，ECP已经被应用于儿童GvHD患者，并且其疗效得到了肯定［30］。

Kanold等［31］根据自己的临床经验和文献回顾对ECP治疗异基因造血干细胞移植后的GvHD进行了总结，提出在Ⅳ级的aGvHD和局限的cGvHD中，ECP应该作为一线治疗方案（与传统的医药方案联合使用），而在对激素抵抗的Ⅱ～Ⅲ级的aGvHD和广泛的cGvHD中，ECP应该作为第二线的治疗方案。Couriel等［32］研究了ECP在激素抵抗的cGvHD患者中的治疗作用。71例患有严重cGvHD的病人进行ECP治疗，其中61%（n43）病情获得缓解，有14人获得完全缓解。其在累及皮肤、肝脏、口腔黏膜和眼器官患者的治疗中获得较好疗效，及早用ECP治疗的cGvHD患者可以获得较高的缓解率。

4 ECP技术研究新进展

ECP作为一项研究历史不长的新技术，还有很大的发展空间，近年来已有不少相关技术研究的报道。如一种新的设备可以自动取病人的外周血，分离出外周血单核细胞，再用8-MOP和UVA处理，整个过程所处的环境条件与病人进行治疗时条件一样，并可很好地在体外研究ECP的治疗机制［33］。国内有学者研究制备出的补骨脂素皮肤用纳米粒载药系统，有可能成为临床上改进补骨素光化学疗法降低其毒副作用的一种新的经皮给药制剂［34］。

5 总结及前景展望

ECP为激素耐药和对激素依赖的aGvHD和cGvHD患者提供了一种较好的治疗选择，其疗效也获得了国外医学工作者的肯定。对其免疫调节机制虽有初步了解，但还需继续深入研究。目前国外对ECP临床治疗GvHD的研究规模逐渐扩大，研究的内容也逐渐扩展。但ECP相对于其他疗法，感染发生率及原发病的复发率如何、ECP治疗是否能减少激素的用量等问题仍需进一步研究，从而获得更多可信的结论。国内对ECP治疗GVHD的研究还不多，相信只要国内外基础和临床医学工作者一起合作，ECP治疗GvHD具有广阔的应用前景。

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