新型大鼠心肌梗死模型制备方式及心脏彩色超声检测

【中图分类号】R445 【文献标识码】A 【文章编号】1672－3783(2011)12－0302－01

【摘要】目的：探讨采用大鼠心脏彩色超声评估新型大鼠心肌梗死模型制备方式的可行性。方法：40只雄性SD大鼠随机分为模型组、假手术组，分别行左冠状动脉前降支永久结扎术和假手术，术后2周行心脏彩色超声检测及心脏组织病理学检查。结果与假手术组比较，模型组大鼠左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率（LVFS）均明显降低，有统计学差异(P

【关键词】心肌梗死；小动物超声；Masson三色；

冠心病，是导致心血管疾病最主要的因素。冠心病是由于长期的动脉粥样硬化斑块或冠状动脉急性闭塞所致冠状动脉管腔的狭窄，两者均可导致心肌梗死（Myocardial Infraction，MI），并最终发展为心衰（Heart Failure,HF）［1,2］在心肌缺血/再灌注(ischemia/Reperfusion,I/R)损伤时防止由冠心病导致的心肌损伤一直以来成为新型的心脏保护性治疗的研究目标［3-5］。目前常用的研究模型包括：永久性左冠状动脉结扎（左前降支，LAD/左旋支，LCX）诱发MI；或暂时的冠状动脉阻塞诱发I/R损伤。I/R模型常用于检测短期的缺血损伤的后果，而MI模型常用与研究心肌的变化。过去的十年，尽管有很多的外科操作方法用于诱发冠状动脉缺血事件的发生，但是LAD结扎仍是最常用的方法［6-8］。因此，我们借鉴目前国际先进的实验动物心肌梗死模型制备方式［9,10］，经过改良，建立了新型、安全、高效的大鼠心肌梗死模型制备方法。

1 实验材料

1.1.1 实验动物及分组 :健康SPF级SD大鼠共40只，雄性，体重170+20g，由天津医科大学实验动物中心提供。随机分为2组，分别行LAD结扎（模型组）和仅开胸，不行冠脉结扎（假手术组。）

1.1.2 实验试剂与仪器：氯胺酮、戊巴比妥、利多卡因、异氟烷、动物麻醉机，开胸操作器械、小动物心脏彩色超声检测仪。

1.2 实验方法：

1.2.1 动物的麻醉：物：氯胺酮（50mg/kg），戊巴比妥钠按照40～50mg/kg的比例进行腹腔注射。麻醉后固定大鼠在鼠板上，取仰卧位。

1.2.2 建立呼吸辅助：使用小动物呼吸面罩，包裹大鼠口鼻，连接小动物麻醉机，使用混合氧（2L/min）和异氟烷（2%）的气体持续通气。

1.2.3 备皮：上界为上肢到脊柱的连线下方0.5cm处，下界平肋弓。用眼科剪剪去左侧胸前鼠毛，范围约2cm，将75%酒精消毒喷洒在包括术野的3cm范围内，铺消毒单。

1.2.4 冠脉结扎：大鼠取平侧卧位，以心尖搏动最强的点下约0.5cm，沿胸骨平行作一纵行切口，依次剪开皮肤、深浅筋膜，钝性分离胸大肌和前锯肌，显露肋骨。于心尖波动点最强烈的部位的上一肋间自胸骨柄左侧横向钝性分离肋间肌，范围约1cm，分离范围不可过广。此刻可看到下方的心脏和肺组织。用一个小棉球将左侧肺叶轻向后推，撕开心包，暴露肺动脉圆锥和左心耳。用镊子掀开左心耳后定位结扎点。通常位于肺动脉圆锥根部和左心耳交界和心尖的连线上。使用6个0的无损伤缝合线进行结扎，从左心耳下方2～3mm进针，进针深度2mm左右，然后打3个外科结结扎血管。打结要控制打结的力度，可见到结扎线水平以下心肌表面迅速变得苍白，室壁运动显著减弱，但又不能力度过大，以免将心肌离断或将结扎线扯断。取出大鼠胸腔内棉球，尽可能使其心脏恢复生理性位置。观察心率，如果出现心律失常，可以在心脏表面滴少量的利多卡因或直接心脏按摩，多数心律失常能够恢复。随后将其自身肌肉对合，然后缝合皮肤。停止动物麻醉机，去除呼吸面罩，大鼠很快出现躁动，手术结束。假手术组仅开胸不结扎冠脉，其余步骤相同。

1.2.5 术后处理：在大鼠腹腔内注入40万单位青霉素以预防感染。将大鼠置于小电热毯上，持续保温约12小时。应保温至少12h。

1.3.1 检测指标(1)一般情况：观察术后大鼠的一般情况，包括活动度及精神状态，统计围术期死亡数，计算大鼠术后存活率及模型成功率。(2)心功能测定：术后2w即可行经胸超声心动图检测（n=20/组）。给与大鼠1％戊巴比妥钠盐溶液按40mg／kg体质量，腹腔注射麻醉后，脱毛剂脱去左侧胸壁体毛，仰卧固定于超声检测鼠板上，同步记录心电图。通过同一个技师对动物盲法检测模型组及假手术组。其不知被检动物的入组情况及是否进行手术。使用的是HP Sonos5500心脏超声仪（Philips,Eindhoven, Netherlands）及一个S12探头（8兆赫兹）［11,12］。除了传统的2维图像，也取得胸骨旁左室短轴的M型图像（见图1）。使用美国心脏超声协会推荐的方法［13］，连续测量3次左室舒张末期内径（LVIDed），和收缩末期内径（LVIDes）。同时计算左室舒张末期（LVEDV）和收缩末期容积（LVESV）。左室射血分数（LVEF）和（LVFS）短轴缩短率分别通过LVEF=1-(LVIDes/LVIDed)2和LVFS=1-(LVIDes/LVIDed)计算。(3)组织病理学检查：检测超声后，取出心脏，观察心脏大体结构，然后在结扎处下2mm处切取0．5 cm厚的横切面心肌组织，放人4%多聚甲醛溶液内固定24小时后，进行常规脱水石蜡包埋切片后，做Masson三色染色。

图1.小动物心脏超声M型图像.A图为假手术组。B图为使用新方法建模后图像。

图2 与假手术组比较，新型大鼠心肌梗死模型制备方式LVEF及LVFS显著降低。*P＜0.05

1.4 统计分析:所有的统计分析使用SPSS（版本10.0）分析。数据使用以χ±s 表示，组间比较采用t检验， 以P

2 结果

2．1 一般状况:两组大鼠术后1-3h均呈强迫卧位，并伴有呼吸急促，模型组呼吸急促表现更为明显。两组均出现毛蓬松竖立，活动量明显减小，饮食水量下降，两组表现差异不明显。术后3h-2w模型组大鼠出现明显嗜睡，毛色变差，活动度差等表现，但假手术组仅术后3天有轻度的活动减低，其后无明显异常。精神及饮食水量与术前比较无明显差异。术后即刻-3d模型组大鼠术中死亡5只(胸腔积液1只，原因不明4只)，手术存活率为75.0％，术后2周未再出现死亡。假手术组大鼠未出现死亡(死于麻醉意外)，手术存活率及术后两周存活率均为100．0％。模型组大鼠心脏大体及病理切片均显示心肌梗死明确，模型复制成功率为100％。

2．2 心脏彩超:和假手术组（LVEF=78±5%)比较，模型组大鼠LVEF显著降低至44.7±2.2%,。同时，LVFS在模型组为20.7±1.4%，假手术组为30.1±1.2%（p < 0.05）。左室收缩末压力（LVID，s）及左室舒张末压(LVID，d)均高于假手术组，差异均有统计学意义（见图2）。

2．3 组织病理学:大体形态观察：术后2周，从鼠尾静脉内注入10％的KCI约0.2ml处死鼠，用PBS冲净心腔内的积血，观察心脏的外形变化，在结扎线以下水平切开心脏，与假手术组的鼠心脏比较，模型组心脏可见明显左心室变形扩大，缺血区室壁变得十分薄弱，颜色暗红，梗死区和非梗死区界限明显。而假手术组心脏大小正常，表面颜色鲜红，与假手术组相比，Masson染色显示模型组心肌细胞纤维瘢痕出现，胶原组织布满全层心肌，梗死区心肌细胞基本死亡。说明结扎冠脉已经造成明确的心肌梗死和室壁组织重构，心肌梗死模型被证实

3 讨论

3．1 动物选择:本研究选择体重170+20gSD大鼠，肋间隙移动度大，骨骼可塑性强，且术后可轻易闭合胸腔，不必缝合肋间，体重过大（＞200g）或体重过小（＜150g）均不适合。

3. 2 麻醉:本研究选用1％戊巴比妥钠盐溶液，按40mg/kg体质量给与腹腔注射麻醉。术中配合动物麻醉机持续给与异氟烷吸入，麻醉过程平稳，利于手术顺利进行。戊巴比妥钠安全范围窄，故在体重250g以下的大鼠，建议不要超过45mg/kg体质量给药。

3.3 人工气道的建立:本研究使用大鼠呼吸面罩持续给痒维持呼吸。较传统气管插管及气管切开术，其对呼吸道刺激小，无呼吸道机械性损伤，术后恢复快速。

3.4 手术方式:本建模方式与以往建模方式比较，有以下优点（1）剪开皮肤采用与胸骨平行的方式，避免横行切开造成皮下大量血管损伤。（2）钝性分离皮下及肌肉，不切开离断，极大程度的减少手术刺激，并保留了肌肉的生理功能，使其后闭合胸腔时，仅需使用其自身的肌肉层原位层层覆盖即可闭合胸腔，避免操作中不必要的损伤。（3）选择在心尖搏动最强点向上一肋横向钝性分离肋间肌，暴露结扎点。（4）结扎过程中使用小棉球轻推肺脏。无论手法多轻柔，轻微的器械刺激即可造成肺脏表面的出血点，而操作导致的周围脏器损伤，是围术期死亡的主要原因［10］。故操作过程中一定要注意保护周围脏器。（5）结扎时采用纱布垫于鼠身下，使心脏尽可能靠近胸壁，避免结扎时损伤周围脏器，且方便准确操作，减少建模难度。

3.6 由于麻醉和失血，术后小动物体温降低，不利于术后恢复，故术后至少保温12小时以上。同时给与抗生素治疗，避免感染。术后12小时内补液也应注意液体的温度，避免不良刺激，且补液量不易过大，否则易造成心脏负荷过重，导致围术期死亡。

3.7 心脏彩色超声检测:心脏彩色超声检测心功能是已被公认的可靠的检测方式，其方便、无创、重复性强。可作为心肌梗死建模常规的检测方式，帮助剔除不符合进一步实验的建模动物，使实验分组统一化。

综上所述，我们从动物选择、麻醉、人工气道建立、手术方式、术后护理等各个方面进一步优化大鼠心肌梗死的建模方式，使其更具操作可行性、重复性，且损伤小，安全性高，极大程度的提高了建模成功率，为临床前研究的需要建立良好的基础。

参考文献

［1］ Libby P. Current concepts of the pathogenesis of the acute coronary syndromes. Circulation. 2001. 104(3): 365-72.

［2］ Thom T, Haase N, Rosamond W, et al. Heart disease and stroke statistics--2006 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 2006. 113(6): e85-151.

［3］ DeGeorge BR Jr, Gao E, Boucher M, et al. Targeted inhibition of cardiomyocyte Gi signaling enhances susceptibility to apoptotic cell death in response to ischemic stress. Circulation. 2008. 117(11): 1378-87.

［4］ Gross ER, Gross GJ. Ligand triggers of classical preconditioning and postconditioning. Cardiovasc Res. 2006. 70(2): 212-21.

［5］ Heusch G, Boengler K, Schulz R. Cardioprotection: nitric oxide, protein kinases, and

作者单位 100027 北京武警北京总队医院1

300222 天津武警天津总队第一支队2（通讯作者）

510420 广州武警广东总队第一支队3

300162 天津武警天津总队医院4