导数紫外光谱法测定人血浆中三唑仑的血药浓度

[摘要] 目的 建立测定人血浆中三唑仑浓度的一阶导数分光光度法，为临床应用提供技术参考。 方法 采用一阶导数光谱法在232.0 nm波长处测定人血浆中三唑仑浓度。 结果 三唑仑在2.55～15.30 μg/mL范围呈良好线性关系；其回归方程为D=1.3487×10-3C+3.7748×10-3（r = 0.9965）；平均回收率为101.53%，RSD=2.12%（n=5）。 结论 该法操作简单，测定结果准确，适用于三唑仑血药浓度的监测。

[关键词] 三唑仑；血药浓度；一阶导数光谱法；治疗药物监测

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（b）-0022-04

Determination of Triazolam in human plasma by derivative spectrophotometry

ZHOU Bolin

Department of Pharmacy， the Ninth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University Beihai People's Hospital， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Beihai 536000， China

[Abstract] Objective To develop first order derivative spectrophotometry for the determination of Triazolam concentration in human plasma to provide the technical reference for its clinical application. Methods The first order derivative spectrophotometry was performed at the wavelength of 232.0 nm. Results Triazolam showed a good linear relationship within a ranger of 2.55-15.30 μg/mL， the regression equation was D=1.3487×10-3C+3.7748×10-3（r= 0.9965）； the average recovery was 101.53%， RSD=2.12% （n=5）. Conclusion This method is simple to operate and accurate in the detection results， and can be applied in the analysis of Triazolam in human plasma.

[Key words] Triazolam； Plasma drug concentration； First order derivative spectrophotometry； Therapeutic drug monitoring

三唑仑（Triazolam）又称甲基三唑氯安定、海尔神，为短效的苯二氮[卓] 类镇静催眠药，三唑仑诱导睡眠的特点是缩短入睡时间、延迟快速动眼睡眠的开始，但不减少其所占睡眠的总比率，可减少第四期睡眠，增加总的睡眠时间、减少夜间觉醒的次数，因此，是失眠患者较理想的药物[1]。本药口服起效快，但是药物过量可出现持续的精神错乱、严重嗜睡、语言模糊、蹒跚、心率减慢、呼吸短促或困难、严重乏力等。三唑仑没有特效的拮抗药，遇到过量或中毒，宜及早进行对症处理，因此，因此监测其血药浓度对临床治疗和中毒抢救均有重要意义[2]。

目前，对三唑仑血药浓度检测的研究报道多为高效液相色谱法[3-5]，紫外导数光谱法检测三唑仑血药浓度未见报道，本文建立了简便、快速、准确地测定血浆中三唑仑浓度的新方法―紫外导数光谱法，为三唑仑的血药浓度监测与药动学研究提供了新的分析手段。

1 仪器与试药

仪器MV-1201型双光束紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司），BP-21lD型电子天平（德国SARTORIMS公司），超声波发生器（上海SBS2200）；三唑仑化学对照品（中国药品生物制品检定所提供）；水为超纯水；甲醇（化学纯）；纯化水由广西医科大学第九附属医院（以下简称“我院”）检验科提供；血浆由我院输血科提供。

2 方法与结果

2.1 测定条件及吸收光谱的选择

2.1.1 溶液的制备

2.1.1.1血浆样品溶液的制备 将三唑仑对照品适量在105℃下干燥至恒重，精密称取10.20 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇适量，振荡2～3 min，加甲醇试剂至刻度，制得三唑仑贮备溶液。精密量取三唑仑贮备溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，用空白血浆（阴性对照液）稀释至刻度，即得（含三唑仑约10.20 μg/mL）。

2.1.1.2 三唑仑对照品溶液 将三唑仑对照品适量在105℃下干燥至恒重，精密称取10.20 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇适量，振荡2～3 min，加甲醇试剂至刻度，制得三唑仑贮备溶液，备用。精密量取三唑仑标准储备液适量，制备三唑仑对照品溶液（浓度：10.20 μg/mL）。

2.1.1.3 阴性对照液 精密吸取空白血浆适量，加入3倍量甲醇沉淀蛋白，振荡3 min，12 000 r/min离心10 min，取上清液备用。

2.1.2 零阶紫外扫描光谱

分别将血浆样品溶液（a液，含三唑仑约10.20 μg/mL），三唑仑对照品溶液（b液，浓度：10.20 μg/mL）、阴性对照液（c液，空白血浆），进行紫外光谱扫描，波长范围为190～400 nm。光谱扫描条件：光度模式为Abs，扫描模式为单一，扫描速度为快速，光谱带宽为2 nm，采样间隔为0.1 nm。图1结果显示，三唑仑与空白血浆之间的紫外吸收相互影响，干扰较大，利用紫外分光光度法无法直接测定血浆中三唑仑的含量。

2.1.3 一阶导数光谱及测定波长的选择

取上述a、b、c溶液，进行紫外光谱扫描，波长范围为190～400 nm。对扫描后的紫外光谱进行导数微积分转换，分别得到3种溶液的一阶导数光谱。扫描条件同“2.1.2”项下，微分波长差为10；缩放系数为1。由图2可见：血浆样品溶液（a液）在232.0 nm波长处的谷-零振幅图谱与三唑仑对照品溶液（b液）相一致，而空白血浆（c液）在此波长处的谷-零振幅值为0，因此，测定三唑仑血药浓度的检测波长可以定为232.0 nm。

2.2 线性关系考察

精密吸取三唑仑标准贮备液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，制成浓度（C）为2.55～15.30 μg/mL的系列工作液，以甲醇为空白，在232.0 nm波长处测定其一阶导数光谱的振幅值D，以浓度C对D进行线性回归，得回归方程：D=1.3487×10-3C+3.7748×10-3（r = 0.9965）。表明三唑仑在2.55～15.30 μg/mL浓度范围内，其一阶导数振幅值D与浓度C呈良好线性关系[6]。

2.3 回收率试验

精密吸取按“2.1.1.3”项下制备的阴性对照液5 mL，分别精密加入浓度为10.20 μg/mL的三唑仑5、10、15、20、25 mL，混匀，按照“2.2”项下测定D值，以D值代入回归方程计算含量，结果见表1。

2.4 精密度试验

取三唑仑对照品液适量，在波长232.0 nm 处重复测定三唑仑一阶导数光谱的谷-零振幅D值，D值为0.0178、0.0171、0.0175、0.0183、0.0172，RSD为2.77%（n=5）。

2.5 稳定性试验

取血浆样品溶液按“2.1.1.1”项下配制后室温放置0、1、2、4、6 h后，分别于波长232.0 nm处测定谷-零振幅D值，D值为0.0216、0.0219、0.0208、0.0210、0.0221，RSD为2.67%（n=5），说明在6 h内血浆样品稳定性较好，对检测结果没有产生不良影响。

2.6 重复性试验

取相同浓度血浆样品5份，按“2.2”项下测定谷-零振幅D值，以D值代入回归方程计算含量，分别为13.44、13.22、12.62、13.59、13.29，各样品中三唑仑含量的平均值分别为13.23 μg/mL，RSD分别为2.62%（n=5）。

3 讨论

三唑仑治疗口服吸收快，没有特效的拮抗药，而且药物中毒的发生和严重的程度与血药浓度呈正相关，因此，检测其血药浓度对临床治疗和中毒抢救均有重要意义。为了确保药物治疗的安全、有效，必须建立一种简单、灵敏、准确的三唑仑血药浓度测定方法。

3.1 检测方法的选择

紫外吸收光谱是由价电子的跃迁而产生的，由于具有不同分子结构的物质具有不同的官能团，因此会选择性地吸收不同波长的光，这样就会产生吸收光谱的差异。因此物质的分子或离子产生的紫外光谱及吸收程度可以对物质的组成、含量和结构进行分析、测定、推断。紫外导数光谱是利用不同物质紫外吸收不同的原理，通过对紫外光谱进行微积分求导，达到清除物质相互干扰的目的，能够对混合物和复杂组分直接进行检测。目前，新型的紫外分光光度计均可利用紫外-可见分光光度计软件系统带有的数学处理功能，对吸收光谱进行处理，可以获得导数光谱。通常可以获得1～4阶导数光谱，在各阶导数光谱中，吸光度对波长的微分值与溶液中组分的浓度C保持线性关系：∝C，其中s为导数的阶数，通过电子学获得模拟导数光谱图，使其应用更加简化、普遍化[7]。

3.2 测定波长的选择

本实验在选定波长时，对所检测的溶液在200～400 nm范围内进行光谱扫描，可以观察到，空白血浆与三唑仑之间的紫外吸收有重叠，干扰较大，利用紫外分光光度法无法直接测定血浆中三唑仑的含量。通过导数光谱笔者发现血浆样品溶液（a液）在232.0 nm波长处的谷-零振幅图谱与三唑仑对照品溶液（b液）的相一致，而空白血浆（c液）在此波长处的谷-零振幅值为0，因此，测定三唑仑血药浓度的检测波长可以定为232.0 nm。

3.3 血浆蛋白沉淀剂的选择

本文在参考现有文献报道[8-10]的基础上，结合本单位现有设备条件，优化了血样处理方法：以甲醇代替乙腈，试剂价格相对低廉；以3倍血样量的甲醇为蛋白沉淀剂，辅以较高转速离心的方法处理血样，蛋白沉淀效果好，提取回收率高，适合紫外导数光谱测定三唑仑血药浓度时使用。

3.4 方法学研究

线性化范围试验也叫标准曲线的绘制，实际是在给定的范围内获取与样品中供试物浓度成正比的试验结果的能力，也就是供试物浓度（或质量）的变化与试验结果（或测得的响应信号）呈线性关系。通常，线性是用最小二乘法处理数据求得回归曲线来表示，回归曲线的相关系数越接近1.00，表明越呈线性。

本实验利用6个浓度点，制订了线性方程[11]：D=1.3487×10-3C+3.7748×10-3，相关系数为0.9965，这表明表明三唑仑在2.55～15.30 μg/mL浓度范围内，其紫外导数光谱振幅值D与浓度C呈良好线性关系，该回归方程可用于紫外导数光谱测定三唑仑血药浓度。

回收率实验也叫加样回收率试验，是衡量误差或准确度的一种方法。是向试样中加入已知量的被测成分，然后进行对照试验，观察加入的被测组分能否定量回收，以此判断分析过程是否存在系统误差，加样回收率一般要求在95%～105%之间为宜[12]，本实验平均回收率是101.53%，符合实验要求。

精密度是指用相同方法对同一试样进行多次测定，各测量值彼此接近的程度。精密度的用标准偏差（S）和相对标准偏差（RSD%）来表示[13]，本实验精密度的RSD为2.77%（n=5），符合实验要求。

重复性实验是指在同一实验室，由同一个操作者使用相同的设备，按相同的试验方法，在短时间内对同一试样（或元件）相互独立进行的试验结果间的一致性[14]。本实验精密度的RSD分别为2.62%（n=5），符合实验要求。

本实验建立的方法，样品处理简单，操作方便，8 min左右即可完成一个样品的分析，分析成本低。吸收峰与血浆药物浓度之间的线性关系良好，专属性强，精密度和准确度高，稳定可靠，为三唑仑的药代动力学研究提供了可靠的分析方法，对开展三唑仑药代动力学研究及治疗药物浓度监测着重要意义，可供药代动力学研究及临床血药浓度检测使用。

[参考文献]

[1] 杨世杰.药理学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2010：352-355.

[2] 刘克辛.临床药理学[M].北京：清华大学出版社，2012：33-37.

[3] 国玉芝，张志国，侯大平，等.高效液相色谱法测定人血浆中地西泮、艾司唑仑浓度[J].黑龙江医药科学，2011，34（2）：67-68.

[4] 郭胜才，李华，谷娜，等.RP-HPLC同时测定血浆中8种苯二氮卓类药物[J].华西药学杂志，2010，25（4）：453-455.

[5] 周志敏，周波林.Rp-HPLC法测定人血浆中三唑仑的浓度[J].中外健康文摘，2013，10（23）：22-24.

[6] 喻荣彬.医学科研数据的管理与分析[M].2版.北京：人民卫生出版社，2009.

[7] 李发美.分析化学[M].5版.北京：人民卫生出版社，2003.

[8] 吕春芳.血浆盐酸二甲双胍的检测及药物动力学研究[J].中国中医药咨讯，2011，3（9）：51-53.

[9] 宋宇红，唐丽琴，胡世林，等.HPLC法测定人血浆中丙泊酚浓度[J].中国药师，2013，16（7）：993-995.

[10] 樊鹏利，张海峰，张磊，等.高效液相色谱法测定利奈唑胺的血药浓度[J].中国现代药物应用，2013，7（21）：227-228.

[11] 季兴繁，邱相君，王勇，等.HPLC法检测人血浆中百草枯的浓度[J].中国药师，2012，15（2）：209-211.

[12] 孙振球.医学统计学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2008.

[13] 马斌荣.医学统计学[M].5版.北京：人民卫生出版社，2010.

[14] 罗家洪.医学统计学[M].5版.北京：科学出版社，2011.

（收稿日期：2014-04-25 本文编辑：卫 轲）