一种新型小分子化合物增强PC3细胞的辐射敏

【摘要】 目的 检测小分子化合物8?氧?8h?苊并[1,2?b]吡咯?9?腈的氨基取代衍生物（s1）对前列腺癌细胞系pc3辐射敏感性的作用。 方法 采用流式细胞术分别检测不同剂量x射线和不同浓度s1化合物以及两者联合作用后，pc3细胞凋亡率的变化；采用western blot方法检测s1作用后不同时间bcl?2蛋白在pc3细胞中的表达变化。 结果 x射线诱导pc3细胞凋亡具有剂量依赖特性，2gy、5gy x 射线照射未发现明显的凋亡，10gy、20gy照射组有明显的凋亡产生 (p<0.01)；s1化合物能够显著诱导pc3细胞凋亡，并具有剂量依赖特性，其中5μmol/l和10μmol/l组凋亡率明显高于对照组（p<0.01）；s1作用后2～12h pc3细胞中bcl?2蛋白表达逐渐减低；s1作用后，分别给予pc3细胞2gy和8gy x射线照射，细胞凋亡率明显高于单独照射组和单独s1作用组（p<0.01）。结论 s1能够增强pc3细胞对x射线的敏感性，可望为临床提高前列腺癌放疗效果，降低辐射损伤提供新的治疗方案。

【关键词】 前列腺癌； 放疗； 增敏

novel small compound sensitizes pc3 cell line to radiation

wu cong?mei1, yin yu?he1, wu de?sheng2

1.school of bioengineering, changchun university of technology, changchun 130012, china;2.research center of reproductive medicine, shantou university medical collegeabstract：objective to determine the role of the heterocyclic compound 8?oxo?3?thiomorpholino?8h?acenaphtho[1,2?b] pyrrole?9?carbonitrile (s1) pyrrole?9?carbonitrile (s1) in sensitizing of human prostate cancer cell line pc?3 to radiation. methods flow cytometry analysis was used to detect the apoptosis ratio of pc?3 cells after treated with different dose of x?ray irradiation or different concentration of s1 or combination of them; bcl?2 protein levels in pc?3 cells treated with s1 in different time point was detected by western blot method. results the results showed that x?ray could induce apoptosis of pc?3 cells with a dose?dependent manner. there was not significant changes in apoptosis of pc?3 cells after 2gy or 5gy x?ray irradiation, however, there was obviously apoptosis after 10gy or 20gy x?ray irradiation (p<0.01). it was also demonstrated that s1 could induce apoptosis ratio change in pc?3 cells with a dose?dependent manner. the ratio of apoptosis percentage in 5μmol/l group and 10μmol/l group was significantly higher than that of control group (p<0.01). bcl?2 protein level was decreased gradually in pc?3 cells treated with s1 for 2 to12h. after treated with s1, pc?3 cells were exposed to 2gy or 8gy x?ray irradiation, the ratio of apoptosis was markedly elevated compared with irradiation alone group or s1 alone group (p<0.01). conclusion our results incated that the small compound s1 could sensitize pc3 cell line to x?rays irradiation. it's a potential new therapeutic method to improve the therapeutic efficiency of human prostate cancers which can decrease radiation?induced lesion.

key words：prostate cancer; radiotherapy; radiation sensitivity

前列腺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一。通过诊断发现，30%～60%的前列腺癌以及几乎全部激素抗性前列腺癌中，有过量的抗凋亡蛋白bcl?2的表达，而且在放疗后的前列腺癌局部再发灶中bcl?2也有明显表达[1?2]。

放疗目前是前列腺癌的主要治疗方法，然而，临床与放射生物学的资料均显示，前列腺癌细胞对于放射具有相当的耐受性。pc3是一种激素非依赖性前列腺癌细胞系，具有高水平的bcl?2 和bcl?xl表达[3]。 x线放射是公认的强凋亡诱导体，而bcl?2 和bcl?xl过量表达保护细胞不被放射诱导凋亡，这使它对化疗或放疗诱导的凋亡具有了耐受性[4]。

研究发现，一种新的小分子化合物8?氧?8h?苊并[1,2?b]吡咯?9?腈的氨基取代衍生物（s1）具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，尤其对于上皮细胞来源的肿瘤具有显著的诱导凋亡作用，有望作为新一代的抗肿瘤化合物或细胞凋亡诱导剂[5]。前期研究证实，s1可以诱导多种肿瘤细胞凋亡，同时降低了bcl?2的表达。因此，本研究检测小分子化合物s1是否能够通过抑制bcl?2的表达从而增强前列腺癌细胞系pc3的辐射敏感性。

1 材料与方法

1.1 材料

pc3 细胞：人雄激素非依赖型前列腺癌细胞，由本实验室保存dmem 培养基常规培养。s1化合物：由大连理工大学张志超教授提供，100% dmso溶解至不同浓度。

1.2 细胞凋亡的检测

选择pc3细胞为靶细胞，将细胞稀释成密度约为5×105cells /ml的细胞悬液，加入96孔细胞培养板中，每孔加入200μl肿瘤细胞悬液。加入不同浓度化合物或给予不同剂量照射。 co2温箱中孵育24h后，冷乙醇固定。上机前洗去固定液，取单细胞悬液，pi染色，采用流式细胞仪检测凋亡比例。

1.3 western blot

采用western blot方法检测bcl?2蛋白在pc3细胞中的表达，人bcl?2抗体购自santa cruz biotechnology。

1.4 照射条件

国产x.s.s.205(fz) 型固定式 x 射线深部治疗机，电压180kv，电流15ma，滤板0.5mm cu +1.0mm al。剂量率0.287gy/min。

1.5 统计学方法

应用spss13.0 统计软件，多组资料检验采用方差分析。

2 结果

2.1 电离辐射对pc?3细胞凋亡的影响

将pc?3细胞接种于6孔细胞培养板，待达到对数生长期，分别用0gy、2gy、5gy、10gy、20gy x 射线照射，48h后收集细胞，用fcm检测pc?3细胞凋亡的变化。pc?3细胞具有一定的辐射抗性，2gy、5gy x射线照射仍未发现明显的凋亡，10gy、20gy照射组有明显的凋亡产生(p<0.01)，而且随剂量增强而增加，细胞平均凋亡率约是0gy对照组的2.09～4.35倍，见表1。表1 不同剂量x射线照射对pc?3细胞凋亡的影响

2.2 s1对pc3细胞凋亡的影响

将pc?3细胞接种于6孔细胞培养板，待达到对数生长期，加入0.2、1、5和10μmol/l不同浓度s1化合物，24h后收集细胞，用fcm检测pc?3细胞凋亡的变化。不同浓度s1诱导pc3细胞凋亡随浓度增加而增加，5μmol/l和10μmol/l组凋亡率明显高于对照组，分别是对照组的4.1～6.8倍（p<0.01），见表2。表2 不同浓度s1化合物对pc?3细胞凋亡的影响

2.3 s1对pc3细胞中bcl?2的蛋白表达的影响

将pc?3细胞接种于 6 孔细胞培养板，待达到对数生长期，给予5μmol/l s1化合物，然后在不同时间，检测细胞中bcl?2的表达。

western blot分析表明，在给予s1化合物后2h，bcl?2的蛋白表达（25kd条带）即有下降，随着时间延长，bcl?2的蛋白表达进一步下降，见图1。

2.4 s1联合x射线对pc3细胞凋亡的影响

将 pc?3细胞接种于6孔细胞培养板，待达到对数生长期，分为6组：对照组，细胞给予假照射；照射组，分别给予2gy和8gy不同剂量x射线照射（与联合作用组同时照射）；s1组给予5μmol/l s1化合物；联合作用组，细胞给予5μmol/l s1化合物，8h后给予2gy和8gy x射线照射。照射后24h所有组细胞收获，用fcm检测pc?3细胞凋亡的变化。

单独8gy x射线或s1化合物作用均可以引起pc3细胞的显著凋亡（p<0.01）， s1化合物作用后给予2gy x射线，细胞凋亡率显著提高，明显高于单独的2gy x射线或s1化合物作用（p<0.01）。s1化合物作用后给予8gy x射线，细胞凋亡率显著提高，明显高于单独的8gy x射线或s1化合物作用（p<0.01），见图2。

3 讨论

前列腺癌是老年男性的常见肿瘤，通常认为欧美地区的发病率较高，但近十年来国内男性的发病率有明显上升的趋势。由于前列腺癌好发于老年人，常常因各种原因而不能进行根治性前列腺手术切除治疗，因此放射治疗成为主要的局部治疗手段[6]。但是，前列腺癌细胞对辐射的抗性严重影响了治疗的效果，因此，提高增强前列腺癌细胞的辐射敏感性成为研究的重要方向。

大连理工大学张志超等研究合成的小分子化合物s1被证实能够诱导多种肿瘤细胞凋亡，在本研究中，我们检测了该化合物对前列腺癌细胞pc3的作用和在辐射诱导凋亡中的增敏作用。

我们首先给予pc3细胞不同剂量的x射线照射，结果证实，2～5gy x射线不能够引起pc3细胞的显著凋亡，照射剂量增高到10gy、20gy时才有有明显的凋亡产生(p<0.01)，因此证实了pc3细胞具有较高的辐射抗性。

然后，我们用不同浓度s1化合物与pc3细胞共培养，结果证实，0.2～10μmol/l不同浓度均可以诱导pc3细胞凋亡，但是只有5μmol/l和10μmol/l能够得到显著的凋亡效果，分别是不加化合物组的4.1～6.8倍。此结果肯定了s1化合物对pc3细胞的诱导凋亡作用。

同时我们检测了在给予5μmol/l化合物后不同时间pc3细胞中bcl?2的蛋白表达。结果证实，在给予s1化合物后2h，bcl?2的蛋白表达即有下降，随着时间延长至12h，bcl?2的蛋白表达进一步下降，从而证实s1可以下调bcl?2蛋白的表达。

抑制pc3细胞中的bcl?2的蛋白表达，调整细胞凋亡途径，可以增强辐射诱导细胞凋亡[7?10]。为了证实这一思路，我们将s1与细胞共培养，然后给予2gy和8gy x射线照射。结果证实，s1能够增强pc3细胞的辐射诱导凋亡率，联合作用明显好于单独的辐射诱导和s1诱导（p<0.01）。其中，2gy单独作用，并不能诱导发生显著的细胞凋亡，而与s1联合作用，其作用效果明显好于2gy单独作用，甚至好于8gy单独作用（p<0.01）。

我们的研究结果证实，s1化合物具有增强pc3细胞辐射敏感性的作用，可望用于增强前列腺癌放疗效果，降低相对等效照射剂量，减少对机体的损伤。

【参考文献】

［1］ shen zj, chen sw, wang h, et al. life?threatening meningitis resulting from transrectal prostate biopsy[j]. asian j androl, 2005, 7(4):453?455.

［2］ wang y, shao c, shi ch, et al. change of the cell cycle after flutamide treatment in prostate cancer cells and its molecular mechanism[j]. asian j androl, 2005, 7(4):375?380.

［3］ krajewska m, krajewski s, epstein ji, et al. immunohistochemical analysis of bcl?2, bax, bcl?x, and mcl?1 expression in prostate cancers[j]. am j pathol, 1996, 148(5):1567?1576.