传染性法氏囊病病毒VP5蛋白的研究进展

【摘 要】传染性法氏囊病是一种严重威胁禽类健康的免疫缺陷性和免疫抑制性疾病，本文对传染性法氏囊病病病毒VP5蛋白的结构、分子学特征、功能学研究进行了阐述，以期对该病的综合防控提供参考。

【关键词】传染性法氏囊病病毒；VP5蛋白；分子学特征

传染性法氏囊病（infectious bursal disease， IBD）是由传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus， IBDV）引起的一种免疫缺陷性和免疫抑制性疾病，病毒主要通过侵害3～6周龄雏鸡的法氏囊中枢免疫器官，给养禽业造成重大损失。IBD最早在1957年首次在美国特拉华州南部的甘波罗镇（Gumboro）发现（故又称甘波罗病）[1]，1962年由Winterfield分离鉴定。迄今为止，IBDV血清型分为血清I型和血清Ⅱ型，但只血清I型病毒有致病性。根据致病特征和抗原性的差异，血清I型中又分为经典毒株、变异株和超强毒株（vvIBDV）[2]。经典毒株以法氏囊水肿为特征，世界各地广泛流行；1985年首次在美国特拉华州地区肉鸡中分离到变异株，导致法氏囊迅速萎缩和严重的免疫抑制，以及感染鸡肝坏死和脾脏肿大，但未见有水肿。1987年，荷兰、比利时等国家报道了超强毒株，后在亚洲、非洲和南美洲均有报道。超强毒株在抗原上与经典毒株相同，但病死率高达30%～70%，法氏囊严重出血，外观呈“紫葡萄”样。

1 IBDV基因组结构

IBDV基因组由A和B两个节段组成。其中A节段含有两个ORF，编码VP2、VP3、VP4及VP5蛋白；B节段只含有一个ORF，编码的VPl蛋白（90ku）是一种RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）。与病毒dsRNA复制有关，同时还具有鸟苷酸转移酶和甲基转移酶活性[3]。VP2、VP3是病毒的主要结构蛋白，构成病毒衣壳的主要成分。VP2具有一个构象依赖性（不连续）的中和抗原决定簇，其诱导的中和抗体能被动地保护宿主不受IBDV感染（变异株和超强毒株除外），故一般认为VP2是病毒的宿主保护性抗原，与病毒中和抗体的诱导、抗原和毒力的变异、细胞凋亡相关；VP3具有一个非构象依赖性（连续）的抗原决定簇，是病毒群特异性抗原。VP4是一种具有蛋白酶活性的病毒多肽，在病毒蛋白的成熟过程中起着重要作用。基因组A节段中大ORF上游并与之部分重叠的另外小ORFA编码非结构蛋白（NP），即VP5蛋白。

2 VP5蛋白的发现

1990年，Hhvarstein通过对IPNV和IBDV核酸和氨基酸序列比对，发现pVP2的N端和C端高度保守，而中间区相对活跃；而且在IPNV和IBDV的A节段发现除了有一个大的ORF（2916bp），还有一个与之重叠的选择性小ORF（444bp），编码一个17KDa的多肽，通过对纯化的放射性（甲硫氨酸）标记IPNV粒子的SDS-PAGE鉴定确定了该蛋白的存在，命名为VP5蛋白[4]。

直到1995年，Mundt等人通过原核表达ORFA-2，获得一个大小为21kDa蛋白，免疫兔子制备多抗，用该多抗在感染IBDV的CEC（鸡胚胎细胞，chicken embryo cells）和感染IBDV鸡的法氏囊样本（western-blot、放射性免疫沉淀、IFA）检测到该蛋白，证明了ORFA-2蛋白的存在（但其大小不是预测的17kDa，而是21kDa左右），由此命名为IBDV VP5[5]。

3 VP5的分子学特征

VP5基因由435～447个核苷酸组成，编码一个含145～149个氨基酸，17kDa左右大小的蛋白。迄今已经报道的VP5基因序列都很保守。氨基酸序列分析表明，IBDV血清Ⅰ型VP5之间（98.6～11%）比Ⅱ型之间（92～94%）保守，而血清Ⅰ型和Ⅱ型之间氨基酸差异较大（28个氨基酸的差异）。但所有的亚型VP5都富含半胱氨酸，这些半胱氨酸大部都很保守，只在105～108之间有所区别。Schroder等通过对嵌合病毒的研究发现，VP5与血清分型无关。基于序列拓扑学的预测表明，VP5是一个Ⅱ型跨膜蛋白，具有细胞质N末端区和细胞外C末端区，在69～88位氨基酸之间存在一个潜在的跨膜螺旋区[6]。

图1

4 VP5的功能学研究

Tan等通过对各个密码子的碱基使用惯性的聚类分析，发现VP5基因碱基聚集习惯不同于其他四种基因，表明该基因来源于病毒的叠印战略，即有通过利用已经存在的基因未使用的阅读框产生新的基因[7]。

Wang等发现VP5在强毒株的减毒过程中发生了特定的氨基酸突变，因此认为其与IBDV强毒表型相关[28]，揭示了Uruguayan hypervirul-ent IBDV株（vvIBDV）缺少目前为止描述的vvIBDV具有的可选性的AUG起始密码子的特征。而是和经典毒株和变异毒株一样，该VP5基因具有一个位于四个密码子下游的AUG起始密码子，因此其编码一条长145个氨基酸的蛋白而不是其他vvIBDV推定的长149个氨基酸的蛋白。尽管如此，这些病毒保留了强致病性毒株的VP5和VP2氨基酸特征，并集聚了vvIBDV相关序列。这一发现可以为VP5可以通过改变翻译起始位点而进化提供证据。

4.1 VP5蛋白与病毒复制的关系

Mundt等人虽然在感染的细胞和组织中检测到VP5，但是未能在病毒颗粒中检测到[9]，证明了其为非结构蛋白，建立了IBDV反向遗传学系统，利用该系统，通过点突变VP5起始密码子（ATGAGG），获得缺失VP5的IBDV突变体，该突变体能够在细胞中复制，但是缺失VP5的IBDV相对于未缺失VP5的IBDV其复制延迟，但最终获得的病毒滴度差异不大，揭示了VP5并不是IBDV在细胞中复制所必需。1998年，YAO等也利用该反转录系统，通过突变起始密码子ATG为终止密码子TAG，沉默VP5，获得VP5缺失突变体，在体外和体内同时证明了VP5不是IBDV复制所必需[10]。

4.2 VP5蛋白与致病性的关系

YAO等发现拯救的VP5缺失感染性克隆，转染CEF后引起的细胞病变明显低于对应的弱毒活疫苗D78，细胞毒性和引起的凋亡程度大大下降；体内实验表明，拯救的VP5缺失感染性克隆，不能引起鸡的病理损伤和该病的临床症状[10]。由此可见VP5在致病性方面起着重要作用。

Qin等在vvIBDV Gx的基础上构建了一株VP5 缺失病毒，将缺失VP5的 IBDV（rGx-F9VP2VP5）和未缺失VP5的IBDV（rGx-F9VP2）体外实验发现该缺失株表现为较低病毒滴度和细胞毒性；体内实验，接毒SPF鸡，在免疫AIV，发现缺失VP5的IBDV其引起的较弱免疫抑制，由此也证明了无论在体内还是在体外，VP5在病毒的复制和致病性方面都发挥着重要作用[11]，同时指出构建VP5缺失疫苗株存在可行性。

4.3 VP5蛋白与细胞毒性和细胞凋亡的关系

Lombardo等[12]通过用IBDV感染CEF、重组痘苗病毒载体感染BSC-1细胞、真核表达载体瞬时转染COS-1细胞这三种途径表达VP5蛋白，免疫荧光分析发现VP5表达后积聚在细胞膜上，并能使细胞膜的通透性升高以致能通过植物血凝素和IgG这样的大分子。VP5的表达呈现出强烈的细胞毒性，包括细胞形态学的改变，细胞膜的破裂和细胞活力的急剧下降，这种细胞毒性和VP5在包膜内侧的积聚均可以被Brefeldin A（BFA）所阻断，因此推测VP5蛋白在子代病毒的释放过程中发挥作用。

Li等通过实验证明，IBDV病毒蛋白5（VP5）是主要的凋亡诱导剂[13]，通过小干扰RNA沉默抑制IBDV VDAC2明显诱导细胞凋亡与下降的caspase-9和3的激活和细胞色素c释放，导致宿主细胞株生长增加。因此，VP5诱导的细胞凋亡在IBDV感染是通过与VDAC2介导的，出现的蛋白质限制病毒复制，诱导细胞死亡。

总之，VP5蛋白在子代病毒的释放过程中，起什么作用，以及如何起作用的，现在还未清楚；由于发表文献的结果矛盾，VP5是否具有细胞凋亡作用，仍未确定。

【参考文献】

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