锁核酸在抗病毒基因诊断与治疗中的应用新进展

基因是现代研究的一个新领域和新热点，PCR技术因准确度和特异性高、灵敏度好等优点受到了医学工作者的青睐。PCR技术能在早期及时发现疾病，做到早预防和早治疗。而基因治疗中的反义寡核苷酸治疗和核酶是从分子水平对疾病进行干预和治疗，具有从源头治疗的优点。但天然的寡核苷酸稳定性差，容易被各种核酶迅速降解，给研究应用带了一大难题。因此需寻找一种物质对寡核苷酸进行修饰，增加其抗酶切能力和提高其稳定性。近年来，锁核酸因其具有稳定性好、分子杂交能力强、抗核酸酶降解能力高、脂溶性好和低细胞毒性等特点而被人们应用于基因诊断和基因治疗。笔者就锁核酸的理化性质、基因诊断与治疗中的应用新进展作一综述，以期为其在病毒诊断、治疗中的应用提供潜在的研究价值。

1.锁核酸的化学结构与理化性质

1.1化学结构 锁核酸（10cked nucleic acid，LNA）也称桥核酸，是一种化学结构较特殊的双环状核苷酸衍生物，其分子结构中含有一个或多个2’-0.4’-C-亚甲基-B-D-呋喃核糖核酸单体，核糖的2’-0位和4’-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥，并连接成环形，形似锁状或桥状，这个环形桥锁定了呋喃糖C3’-内型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架的局部结构的稳定性。LNA的特殊构象能够导致核酸骨干的预组装，在某种程度上增加碱基堆积力，有利于双链形成。

1.2理化性质 由于LNA化学结构的特殊构象，其理化性质比其他寡核苷酸具有更突出的势：①提高与补序列的杂交高亲和性：因为LNA碱基与DNA、RNA的磷酸盐骨架相同，LNA碱基与互补序列杂交时不但具有更高亲和力，而且这种相同的磷酸盐骨架能使互补序列被LNA容易识别，从而形成高亲和力的杂交物。②增加互补双链的热稳定性：LNA单体增加到寡核苷酸链中时，其解链温度（Tm）可明显提高，在LNA与DNA形成的杂交双链中，Tm可提高2℃-6℃，在LNA与RNA形成的杂交双链中，Tm可提高3℃-9℃，可见与互补双链的热稳定性明显增加。③改善抗核酸酶切割能力：血液中siRNA不稳定，极易被大量的核糖核酸酶迅速分解，在siRNA 3’末端被LNA单体修饰后，siRNA抗核酸酶切割能力和在血清中的半衰期明显提高。④LNA的无毒性：注射反义LNA后，通过检测小鼠血清肝肾功能生化指标和病理切片HE染色，未发现有明显变化。⑤LNA与DNA或RNA结合时，错配辨别力更强。⑥LNA水溶性好，自由出人细胞，易被机体吸收。正是因为LNA所具有的这些优势，近年来不管是在基因诊断还是基因治疗中，LNA成了学者的研究热点。

2.LNA在抗病毒诊断中的应用

2.1乙型肝炎病毒（HBV）检测 在治疗慢性乙型肝炎时，核苷类似物如拉米夫定（LAM）、替比夫定、阿德福韦（ADV）等被长期应用于抗乙肝病毒（Hepatitis B Virus.HBV）治疗并一定程度上抑制了病毒的复制。但是长期使用这些抗病毒药物可使病毒基因发生变异，产生耐药，最终引起无效治疗和影响后期的康复。因此，测定先存或新形成的HBV抵抗菌株在临床治疗中对抗病毒治疗方法选择有着重要意义。目前检测耐药HBV一般由直接测序法完成，但是这种方法耗时，更重要的是无法同时检测混在同一样品中野生型和变异型的种群，因此不适合常规的临床应用。普通PCR扩增病毒DNA的种群测序法敏感性较低，当新形成的变异株数量较少或是中止治疗后变异株降低时难以鉴别。其他的方法比如线性探针分析法，敏感性虽然比普通PCR扩增病毒DNA的种群测序法增加5%-10%，但是变异株的数量常常在它的检测最低水平以下。建立一种灵敏、特异、准确、快速、方便的检测方法对于慢性乙型肝炎感染者抗病毒治疗中耐药性的确定和监测具有重要意义。有研究者构建聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）与Real-time PCR-LNA-TaqMan探针.并用这两种方法与直接测序法检测拉米夫定药物治疗的乙肝患者血清HBV，实验结果显示，PCR-RFLP与Real-time PCR-LNA-TaqMan探针法可以检测野生型YMDD和它的变异型YIDD和YVDD，但Real-time PCR-LNA-TaqMan探针法鉴定耗时少，更敏感。Wang Q等用同样的方法检测15例单纯HBsAg（+）样本，结果有4例HBsAg（+）样本未能被普通TaqMan探针检测出阳性，而使用LNA-TaqMan探针法检测全为阳性。Sun z等建立TaqMan-LNA探针多重实时PCR（multiplex realtime PCR）方法鉴别野生型和突变型菌株。研究发现这种灵敏的方法可以定量10拷贝的HBV，能检测10拷贝野生型HBV中存在低至1%的突变型，而且分析30例HbsAg（+）血清样品只需要3.5小时。用等位基因特异性锁核酸实时荧光定量PCR（RT-AS-LNA-q PCR）方法.通过序列匹配标准对变异型和野生型HBV定量，实验中能准确检测占总菌数水平0.1%或以下的17种不同的核苷酸变异且进行基因分型。Zeng Y等用同样的方法检测野生型、突变型标准质粒时，证实了该方法线性范围宽和检测下限低，而且准确度高。

2.2丙型肝炎病毒（HCV）检测 HCV病毒载量的测定是慢性丙型肝炎治疗管理必不可少的一部分。常用的血清和血浆的HCV RNA定量非常耗时且试剂用量大，另外，一些存留在细胞内如外周单个核细胞（PBMC）、冷沉淀剂、吸附在红细胞或血小板的病毒RNA无法检测。因此，定量血清或血浆HCVRNA往往低于总的循环病毒载量。虽然检测存留在PBMC和全血的HCV RNA可为干扰素治疗结束后预测病毒复发，然而定量分析PBMC病毒动力学只能提供微小的预测信息，而且PBMC分离、计数、洗涤程序也较为烦琐，因此，或许全血定量HCVRNA可以作为最佳选择。但是，尚未有研究证实是否用全血定量HCV RNA比血浆或者血清具有更高的诊断敏感性。Bruns T构建LNA合成的核苷酸衍生物2’-0-甲基RNA（2’-ome-RNA）形成稳定的复合物而更能抵抗核酸酶的降解，因此LNA修饰的寡核苷酸能提高RNA的提取率。从222份临床血浆样本，82份用LNA介导的捕获方法提取HCV RNA，实时反转录PCR（real-time reverse transcription-PCR）定量，结果与试剂盒H AmpliPrep/TaqMan（CAP/CTM）HCV测试比较，这个实验的分析敏感性为9IU/10微升样品，线性范围为500-5×10 IU/ml，在血浆准确测试10个HCV亚型：血浆和全血样品检测结果是相等的（决定系数R2=0.943）和在全血异性为100%（n=20）；敏感性在血浆浓度为95%检测极限时全血样品为100%（n=141）；10微升全血定量结果与HCV血浆测试结果具有相关线性（R2=0.919；n=140）。目前检测人类肝组织HCV的方法主要有免疫组织化学、原位杂交（ISH）、原位RT-PCR，但是免疫组织化学和ISH重复性较差，原位RT-PCR虽然敏感性好，但伴随着较高的假阳性率。为了寻找可靠诊断的组织化学技术检测肝组织HCV，设计LNA探针ISH技术和生物素释放信号扩增系统（biotin-free catalyzed signal amplification sys-tern，CSAII）检测中嵌合体小鼠和丙肝患者肝组织HCV RNA，结果显示阳性率分别为100%（13/13）和82%（9/11），在慢性乙肝损伤、脂肪肝、自身免疫性肝炎、原发性肝癌中HCV RNA均是阴性。证明了LNA探针ISH技术简单可靠，适用于常规细针活检检测丙肝患者肝脏中HCV RNA。

2.3HIV检测 精确检测血液中HIV DNA和RNA，o论诊断是否HIV感染，还是评估HIV病人治疗后病毒载量、病毒复制的治疗效果都起到重要作用。但在广泛使用抗病毒治疗的环境下，HIV-1由于基因变异产生了药物抵抗，但其机制非常复杂.当产生药物抵抗时需要改变治疗方案。HIV的单核苷酸基因多态性（single-nucleotide polymorphism，SNP）给各种传统的检测方法检测提出了难题，一方面HIV-1 M组HIV-1亚型遗传多样性，无法与多种变异型特异性结合，目前大多数的荧光定量PCR只适合定量HIV-1 B亚型；另一方面为使探针退火温度达到最佳，传统的Taqman探针包括25至35个核苷酸。由于HIV-1自然的异质性，很难在200个碱基对中找到三个保守区（两个为引物一个为内部探针同源序列）包括所有或大部分HIV-1 M组亚型，这造成了检测时灵敏性降低。因此需要一种灵敏、高效的实验方法监测HIV-1型的治疗。许多学者在各种方法的基础上用LNA修饰改良而使检测的敏感性和特异性上升。因为构建的LNA Taqman探针比普通的Taqman探针更短，与HIV-1亚型保守序列杂交的靶标也相应变短.可以有效克服传统探针的局限性，应用于HIV-1分型中有更宽的检测范围、更灵敏检测下限，可广泛适用于HIV-1的分型。在阳性干血斑（dfled blood spots，DBS）中，HIV-1 DNA检测灵敏度也达到了100%，结果与血浆的HIV RNA水平显著相关（r=0.765，P

3.LNA在抗病毒基因治疗中的应用

3.1HBV基因治疗 HBV是一种有包膜的嗜肝DNA病毒，目前HBV可被分为A-J共10种基因型，每种基因型又可进一步分为若干个基因亚型。流行于我国的HBV基因型主要为B和C基因型，其中，B型又以B2亚型为主，主要流行于广西、广东、海南等南方地区：C型主要有C1和C2两种亚型，主要流行于我国北方地区。乙肝病毒感染可引起病毒性乙型肝炎，是一种传染性较强的疾病，如果得不到有效控制，易发展为肝硬化甚至肝癌，对人类的危害已经成为全球性问题，而中国是重灾区之一。目前临床上治疗慢性乙型肝炎仍然缺乏特效药物，主要应用核苷酸类似物或干扰素等药物抗病毒治疗。这种抗病毒疗法虽然在一定程度上能降低人体内的病毒载量，但无法完全清除，因此需探索一种更有效的策略治疗乙肝病毒引起的乙型肝炎。基因治疗是近年来的研究新热点，其中反义LNA做了大量的研究并取得了一定的成果。反义LNA治疗，其作用原理是通过与特定的病毒mRNA结合，发挥基因“封条”或酶切割作用，使靶mRNA表达受抑制或降解，从而达到治疗目的。LNA起到了增加反义寡核苷酸的热稳定性和亲和力作用。在体外细胞实验中利用拉米夫定抗病毒药物与HBV S基因反义LNA对比抗病毒效果，研究发现，拉米夫定对HBV DNA抑制效果明显，但对HBsAg、HBeAg抑制较弱，而反义LNA对这三个检测指标都有明显的抑制作用，效果比拉米夫定更好。邓益斌等在细胞实验中设计反义LNA研究其在细胞的抗病毒效果，实验证明了对HBV DNA、HBsAg、HBeAg有强的抑制作用，且对细胞的新陈代谢无明显影响。在体外细胞实验中，反义LNA对HBV的复制和表达表现出了强抑制作用。在进一步的研究中针对HBV S、前C/C、S/C靶点设计反义LNA，并在转基因小鼠体内验证对HBV抑制其表达，结果发现，和细胞实验一样对HBV有明显的抑制作用，通过实验检测小鼠血清肝功能和肾功能指标及肝、肾组织结构病理检查，与对照组相比，锁核酸治疗组的肝功能和肾功能无明显差异，表明了锁核酸在体内的无毒性和安全性。单靶区和双靶区对HBV都有较强的抑制作用，但双靶区抑制效果明显高于单靶区，证实了联合多位点设计的反义LNA能更有效抑制HBV。这些研究都证明了HBV的反义治疗是有效的，不过由于反义治疗的作用位点是mRNA，虽然一定程度上能抑制HBV的生成，但是并没有从源头抑制HBV DNA，其可以不断地表达。因此提出抑制HBV DNA的反基因治疗可能获得更大的抑制效果。反基因治疗是由外源特定寡聚脱氧核苷酸与病毒双链DNA的特定区域专一性结合，形成三链DNA分子，从而阻断靶基因的复制与转录，实现“反基因”之目的。在国内对反基因LNA治疗HBV有了初步研究.Y.-B.Deng等针对乙肝病毒S基因同聚嘌呤区设计反基因锁核酸细胞实验，研究对HBV的抑制和表达，实验结果表明，该实验对HBV具有明显的抑制能力。Sun z等在实验中证明了通过脂质体介导的反基因LNA能有效地穿过细胞核与靶HBV DNA发生特异结合而抑制其复制表达，抑制能力比反义LNA与pgRNA的抑制作用更强，显示出了反基因具有更强大的抑制能力和发展空间。但是目前的研究只是在细胞实验中进行，是否在体内一样具有抑制作用和安全性有待进一步的研究。

3.2HCV基因治疗 丙型肝炎是HCV引起的一种传染性疾病，其传播途径主要是通过血液进行传播，急性感染者有70%-85%可发展为慢性丙型肝炎，如果得不到有效治疗，长期发展可能转变为肝硬化、肝癌。因为丙型肝炎及其引发并发症每年造成的死亡人数为35万-50万。HCV在分类中属于单股正链RNA病毒，由5’非编码区（5’NCR）、结构区（C、E区）、非结构区（NS区）和3’非编码区共4个区域组成，其中5’非编码区和结构区C区的序列非常保守。5’NCR中的内源性核糖体进入位点（internal ribosome entry site.IRES）是HCV基因组中的翻译起始位点，是HCV复制所必需的元件之一，其在病毒基因表达调控中发挥着重要的作用。Christopher J.Nulf等针对IRES设计反义钛核酸（peptide nucleic acid，PNA）和反义LNA与IRES序列关键位点结合以达到阻断翻译的目的，研究结果发现，PNA和LNA都能有效地侵入HCV IRES的重要序列并阻断翻译。而Carl Laxton等在研究中不仅证明了反义LNA的有效抗病毒活性，半衰期长（>5天），到达肝最大浓度>100倍体外抗病毒活性所需的浓度，而且也验证了其低的细胞毒性。近年来，在脱氧核酶的两条结合臂上增加LNA而形成的锁核酸核酶（LNAzyme）切割破坏IRES和C基因抑制病毒基因的表达也取得了一定的进展。针对HBV 5’非编码区合成LNAzyme、硫代DNAzyme、DNAzyme三种核酶，实验结果发现，三种核酶中，LNAzyme对HCV RNA复制和荧光素酶基因表达具有更强的抑制作用，且随用药时间延长，抑制率呈增高趋势，用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法监测细胞活性未发现有明显改变。另一研究中观察双基因靶位和单基因靶位抑制作用时，结果HCV RNA和荧光素酶的抑制率在各组中分别为：单靶区NCR组62.12%，66.49%；单靶区C组61.39%，65.06%；双靶区NCR/C组75.37%，73.30%，结果表明了双基因靶位的抑制率优于单基因靶位。微小RNA（microRNA，miRNA）由21-25个核苷酸组成，属于非编码RNA。肝脏中含有大量的miRNA.而miR-122是含量最多的一种.约占肝脏所有miRNA总量的72%。miR-122对肝脏的正常功能和分化调节具有关键作用，但在丙型肝炎患者中大量表达，能促进HCV的复制和蛋白的表达。Miravirsen（SPC3649）是一种由LNA修饰的硫代反义寡核苷酸治疗药物，它的作用原理是与miR-122发生特异性结合，并且形成高度稳定的杂交双链，阻断miR-122对HCV的调节，最终抑制HCV的复制。最近报道，SPC3649通过结合pri-和pre-miRNAs的茎-环结构而抑制miR-122的生物活性。最初实验用antagomir-122，miR-122ASO，LNA修饰的寡核苷酸在鼠体内进行，结果三组都有效地减少肝脏miR-122水平和血清胆固醇水平，并未观察到毒性效应。在这些ASO中，LNA高亲和力修饰寡核苷酸（SPC3649）对miR-122抑制能力最强。因此SPC3649随后进一步在灵长动物上研究其安全性和效果。SPC3649的安全性测试在猕猴身上研究，显示可以降低血清总胆固醇并有剂量依赖性，无严重毒性作用，证明了miR-122抑制药物没有影响肝的形态和功能。HCV慢性感染的黑猩猩用SPC3649治疗显示长期抑制HCV复制而没有副作用。随着临床前研究的成功完成，SPC3649进入人类临床试验。第1阶段的研究数据表明SPC3649有好的耐受性和剂量限制毒性，减少血清胆固醇水平。第2a阶段临床研究，评估多剂量SPC3649治疗miR-112安全性、耐受性、药物代谢动力学、疗效，研究发现，SPC3649具有广泛的抗病毒活性，有剂量依赖性和持续减少血清胆固醇和HCVRNA水平，并且未观察到HCV基因组中存在mir-122结合位点的病毒抵抗，也未发现剂量限制性的不良反应事件。SPC3649比其他抗HCV药物有几个优点，不像大多数抗病毒药直接作用于HCV，而是作用于miR-112能避免由于HCV基因组突变引起的药物抵抗。

3.3HIV基因治疗 自从高效抗反转录病毒治疗（highly active antiretroviral therapy，HAART）被用于临床治疗艾滋病以来.虽一定程度上抑制患者HIV-1并改善病程发展，但是长期HAART会导致病毒耐药和突变等问题，从而使治疗艾滋病的效果逐渐下降。目前应用于HIV-1基因治疗的策略主要包括反义RNA、RNA适体、核酶、RNA干扰、RNA诱饵和一些基于蛋白的抑制剂。LNA被应用这些治疗方法中是为了增加靶向性和稳定性而增强抑制HIV-1作用。有研究比较反义DNA、反义LNA、LNA核酶、DNA核酶在细胞培养中阻断HIV-1 RNA模板反转录和二聚作用的生物活性并抑制HIV-1生成，结果证明抑制HIV-1表达能力：反义LNA>LNA核酶>DNA核酶>反义DNA。Elmen J等在HIV-1保守区二聚作用起始位点（dimerization initiation site，DIS）应用反义LNA提高了抑制HIV-1的性能。另有研究鸟嘌呤-四联体序列5’-TGGGAG和17-mer序列T30177利用LNA修饰后抗HIV-1活性提高8倍。HIV-1反式激活应答元件（TAR）RNA59残基茎，环结构干扰HIV反式激活蛋白Tat和其他细胞因子刺激病毒长末端重复（long terminal repeat，LTR）的转录延长，从而达到阻断全长的艾滋病毒转录和复制的目的。研究中发现长度相同（12个残基）的2’-0-甲基寡核糖核苷酸（2’-O-methyl oligoribonucleotide，OMe）、OMe/LNA、PNA都同强度与TAR结合并抑制HIV-1转录。此外，当通过阳离子脂质体转染Hela细胞.发现3’-羧基荧光素标记的12-mer OMe/LNA嵌合寡核苷酸可抑制特定序列。另有报道发现OMe寡核苷酸与40%-50%LNA（包括a-L-LNA or 29-硫代-LNA）杂合效果最佳，且长度不能低于12残基。LNA应用于HIV-1基因治疗方法中还有RNA适体。适体（aptamer）是奶逋夤押塑账嵘秆〉哪芙裘芙岷习蟹肿拥囊欢DNA或RNA。适体与RNA发夹结构通过环一环相互作用相互影响.被称为识别RNA发夹结构的另一种反义寡核苷酸。其在抗HIV-1的应用研究多用于与反转录病毒蛋白Tat的肽竞争结合于TAR，即使两个配体的结合位点不重叠。一旦结合，适体TAR采用合适构象不再适合与Tat产生联系，最终抑制HIV-1。相对比，反义LNA虽与适体都具有较强的结合力和碱基配对潜能，但不能竞争于Tat。更重要的是我们发现LNA/DNA适体结合于TAR的特异性比LNA/DNA反义寡核苷酸高。

4.问题与展望

锁核酸给被修饰物带来极好的亲和力和非常高的生物稳定性，无论在基因诊断还是基因治疗上都起重要作用。也正是如此，LNA修饰寡核苷酸在设计时比普通寡核苷酸更短，而且LNA结构的灵活性使设计时容易达到设计者的期望，展现出了强大的效力，在临床上比其他长的寡核苷酸具有更低的毒性。随着进一步理解LNA的生理学和分子杂交热力学及临床实验的不断发展，将会更完美设计LNA，并提高其在不同领域中应用。