限制性核酸内切酶相关知识总结

限制性核酸内切酶是生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。限制性核酸内切酶主要存在于原核生物，它的功能是能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶(简称限制性内切酶或限制酶)。它不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase），限制性核酸内切酶的切点大多很严格，要求专一的核苷酸序列。限制性核酸内切酶按其性质可分为三大类，即所谓Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型酶，基因工程最常用也是高中生物所指的限制性核酸内切酶即为Ⅱ型酶。新课标高中生物必修2――遗传与进化模块中“基因工程及其应用”这一节对限制性核酸内切酶作了一定的介绍，但笔者在教学过程中发现部分学生概念有些模糊，做题准确率不高。因此笔者总结了有关限制性核酸内切酶的知识点，并结合近年来的高考真题，对该酶作一次较为详细的总结。

1. 限制性核酸内切酶的相关知识点

限制性核酸内切酶识别序列的长度一般为 4-8 个碱基，最常见的为 6 个碱基。一般情况下，不同的限制性核酸内切酶具有不同的识别序列和酶切位点。但这并非绝对，部分限制性核酸内切酶具有相同的识别序列，但切割的位点不同，如Xma I和Sma I都识别六核苷酸CCCGGG，然而它们的酶切位点分别是CCCGGG和CCCGGG；有些限制性核酸内切酶不但具有相同的识别序列，连酶切位点都一样，如BamH I、Bgl Ⅱ、Bst I这三种酶，它们的识别序列及切割位点都为GGATCC。

不同的限制性核酸内切酶切割双链DNA所形成的末端通常是不同的，有的酶切割后切口是平的，即形成平末端，如AluⅠ和HaeⅢ。有的切口可带有一个短的单链末端，即黏性末端，如EcoRⅠ和HindⅢ。有些限制性核酸内切酶识别序列不同，但是产生相同的粘性末端，称为同尾酶，如BamH I(GGATCC)和Bgl Ⅱ (AGATCT)，由此产生的DN段可借黏性末端相互连接，使DNA重组在操作时具有更大的灵活性。

2. 高考真题：

（09江苏高考，生物卷）苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图(ampr为抗氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。

(1)将图中①的DNA用Hind Ⅲ、BamHⅠ完全酶切后，反应管中有种DN段。

(2)图中②表示 Hind Ⅲ与BamHⅠ酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得 种重组质粒；如果换用BstⅠ与BamHⅠ酶切，目的基因与质粒连接后可获得种重组质粒。

解析：（1）首先我们应该注意到BamHⅠ和Bstl这两种限制性核酸内切酶所识别的序列和酶切位点都相同，即这两种酶可以互换使用。将图中①的DNA用HindⅢ、BamHⅠ去酶切，共有3个酶切部位，因此完全酶切后反应管中有4种DN段（如右图所示）。

（2）通常质粒和目的基因分别用相同的两种限制性核酸内切酶酶切后才能用DNA连接酶把质粒和目的基因连接起来。因此经Hind Ⅲ与BamHⅠ酶切后的图①的DNA只有②、③两个片段能与质粒连接形成重组质粒，即可获得2种重组质粒。如果换用BstⅠ与BamHⅠ酶切,那目的基因切割后形成的片段如下图所示

其中只有②这个片段才能和经BstⅠ与BamHⅠ酶切后的质粒连接在一起。因此可形成的重组质粒为1种。

（2005 天津理综）（1）限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是―GGATCC―，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是―GATC―。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。

①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。

②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。

③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接起来？为什么？

解析：题目所给的只有一条单链和酶切位点，要求我们画出该限制性核酸内切酶切割后形成的黏性末端，具体方法可以分三部走：①根据碱基互补配对原则，将限制性核酸内切酶所识别的核苷酸序列的另一条互补链写出来，得到双链DN段。②标出两条链上被限制性核酸内切酶能识别的切点。③经过两条链上的切点画虚折线（即切口）画出被限制酶切割后所形成的黏性末端。因此答案为

被限制性核酸内切酶切开的DNA两条单链切口，各含有几个伸出的、可互补配对的核苷酸，这就是黏性末端。黏性末端之间，只要切口处伸出的核苷酸间存在互补，就能在DNA连接酶的作用下连接起来。从上图我们可以看出，虽然限制性核酸内切酶I和酶II识别的序列和切点不同，但形成的黏性末端是相同的，存在着互补关系，因此在DNA连接酶的作用下是可以连接起来的。