基于“分段”“完整”转化的G―四链体脱氧核糖核酸酶传感器用于多聚核苷酸激酶的检测

摘 要 采用“分段”转化为“完整”G-四链体脱氧核糖核酸酶的策略，构建了检测多聚核苷激酶（T4 PNK）的传感器。将形成G-四链体的富G序列PS5.M序列拆分成5′和3′端均为羟基的两条链：链S1OH和链S2OH，即分别具有12个碱基的“分段”的PS5.M。在ATP存在下，T4 PNK酶可以将链S2OH的5′端的羟基磷酸化，转化为S2P；在S1OH、S2P以及Helper链SH存在下，T4 DNA连接酶（T4 DNA Ligase）将链S1OH和链S2P连接成“完整”的PS5.M序列。在体系中再加入核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ），从SH的3′端剪切SH，释放出PS5.M。在K+存在下， PS5.M与氯化血红素（Hemin）作用，形成具有类过氧化物酶活性的复合物，催化H2O2氧化2，2′-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）的反应，通过检测氧化产物在418 nm处的吸收值变化，实现对T4 PNK活性的定量检测。线性检测范围为0.02～3.0 U/mL，检出限为0.014 U/mL（S/N=3）。对Hela细胞和HEK293细胞实际样本的T4 PNK活性进行了检测，平均回收率为95.6%～105.7%。

关键词 多聚核苷酸激酶； 脱氧核糖核酸酶； G-四链体； 生物传感器

1 引 言

T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）是Richardson于1965年研究T4噬菌体侵袭大肠杆菌的过程中发现的[1]。T4 PNK酶可以催化ATP的γ-位或3′-单磷酸核苷的磷酸基团与寡核苷酸链（双链DNA和单链DNA或RNA）的5′-羟基基团进行转移和交换，实现寡核苷酸的5′磷酸化或者3′去磷酸化，在基因克隆、载体制备和核酸的损伤与修复中具有非常重要的作用[2]。因此，发展快速、简单、灵敏的分析方法用于检测T4 PNK在核酸代谢和分子靶向治疗等研究领域具有重要的实际意义。

近年来，在放射性同位素32P标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影等传统检测方法[3，4]的基础上，发展了一些快速检测T4 PNK的新方法。这些方法主要基于分子信标技术[5]、发夹型荧光探针技术[6]、氧化石墨烯淬灭技术[7]、金纳米粒子显色技术[8]以及电化学检测[9]等，以实现对T4 PNK的快速检测。

1990年，通过体外筛选技术产生了第一个RNA酶，后来发现具有剪切RNA及连接DNA的DNA酶[10]，使DNA分子跨进生物催化的大门[11，12]。与蛋白酶相比，DNA酶具有合成简单、易于修饰及热稳定性好等特点，在生物传感器的研究中占有重要地位[13]。G-四链体是由富含鸟嘌呤碱基G的DNA或RNA序列形成的特殊核酸二级结构[14]。研究发现，一些G-四链体DNA与氯化血红素（Hemin）结合形成的复合物，可以催化H2O2参与的反应，具有类过氧化物酶的活性[15，16]。G-四链体脱氧核糖核酸酶的这一特性已被广泛应用于多种分析物的放大检测[17～21]。本研究选用富G的DNA序列PS5.M为模型，其与Hemin结合后，可以催化H2O2氧化2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）的反应[22]，将其裂分为两条寡核苷酸链S1OH和S2OH，由T4 PNK磷酸化S2OH为S2P，与链S1OH和Helper-DNA链SH杂交后，在T4 DNA连接酶的连接作用下，形成PS5.M与链SH的双链结构，最后由核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）切掉链SH，释放链PS5.M。利用PS5.M与Hemin结合后形成DNAzyme，催化H2O2氧化ABTS的反应，通过检测体系在418 nm的吸光度变化，实现对T4 PNK 酶的定量检测。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Lambda 25 紫外-可见分光光度计（PerkinElmer公司） ，测量时使用微量样品池；Biophotometer 核酸蛋白仪（Eppendorf公司）；ChirascanTM-plus 圆二色光谱仪（Applied Photophysics公司）。

实验中所用到的寡核苷酸链：S1OH（5′-GTGGGTCATTGT-3′）、S2OH（5′-GGGTGG GTGTGG-3′）、PS5.M（5′-GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG-3′）、5H8（5′-ACCCACACAA-3′）、5H10（5′-CACCCACACAAT-3′）、5H12（5′-CCACCCACACAATG-3′）、5H14（5′-CCCACCCACACAATGA-3′）、5H16（5′-ACCCACCCACACAATGAC-3′）及5H18（5′-CACCCACCCACACAATGACC-3′）均由上海生工生物技术有限公司定制合成。其浓度通过测量260 nm处的吸光度值及相应的摩尔吸光系数计算得到。每条寡链核苷酸链的摩尔吸光系数由网站（http：///analyzer/Applications/ OligoAnalyzer）提供的软件计算得出。配制的寡链核苷酸储备液分装后于20℃保存。

4-羟基乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），NaOH、NaCl、KCl、曲拉通-100（Triton X-100）和H2O2（国药集团化学试剂有限公司）。T4 多聚核苷酸激酶（T4 PNK，10 U/μL）、10×T4 PNK反应缓冲液A、T4 DNA连接酶（10 U/μL）、10×T4 DNA连接酶反应缓冲液（Thermo公司）。核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ，200 U/μL），10×Exo Ⅲ反应缓冲液（Takara公司）。5′-三磷酸腺苷二钠盐（ATP二钠盐）、氯化血红素（Hemin）和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）购自Sigma公司。实验用水为超纯水（18.2 MΩ cm）。

2.2 T4 PNK 磷酸化实验

每个样品的反应总体积为2.0 μL：其中含20.0 μmol/L链S2OH，1×T4 PNK 缓冲液A， 1 mmol/L ATP， T4 PNK分别为 0.02，0.05，0.08， 0.1，0.2， 0.3，0.5，1.0，2.0和5.0 U/mL， 其余由灭菌水补齐。将样品均匀混合后，置于37℃水浴中反应30 min，再置于75℃水浴中失活10 min，冷却至室温，进行下一步DNA杂交实验。

2.3 DNA 杂交实验

DNA杂交实验总体积为17 μL：其中T4 PNK实验中反应后的样品2.0 μL，链S1OH（20 μmol/L）2.0 μL， 链Helper DNA（20 μmol/L）2.0 μL，10×T4 连接酶反应缓冲液2.0 μL，其余由灭菌水补齐。将样品混匀后置于95℃水浴中5 min，再缓慢降至室温，进行下一步连接酶实验。

2.4 连接酶实验

连接酶实验样品的总体积为20 μL：向上述DNA杂交实验的样品（17 μL）中加入ATP（10 mmol/L）1.0 μL，T4 DNA 连接酶2.0 U/mL。将样品混匀后置于22℃水浴中1 h，再置于75℃的水浴中10 min后，进行下一步实验。

2.5 核酸外切酶Ⅲ实验和吸收信号检测

核酸外切酶Ⅲ实验样品的总体积为30 μL：向上述连接酶实验的样品（20 μL）中加入10×Exo Ⅲ反应缓冲液3.0 μL，溶液中Exo Ⅲ酶终浓度为2.0 U/mL，最后由灭菌水补齐，将样品混匀后置于37℃水浴中30 min，再置于75℃的水浴中10 min后，用于下一步吸光度测量。

吸光度信号检测实验的样品总体积为40 μL：向上述核酸外切酶Ⅲ实验的样品（30 μL）中加入各物质， 使终浓度为H2O2 4.0 mmol/L，Hemin 2.0 μmol/L，KCl 40 mmol/L，NaCl 100 mmol/L，Triton X-100，0.008%和ABTS 1.0 mmol/L，由HEPES缓冲液（20 μmol/L，pH 8.0）补齐体积。其中ABTS在测量前加入，混匀后迅速测量样品的吸光度。

UV-Vis分光光度计的扫描波长范围为400～500 nm，扫描速度为240 nm/min，取418 nm处的吸光度值绘制相应的标准曲线， 并计算回收率。

2.6 圆二色（CD）光谱检测

按2.2～2.5节完成每个步骤反应，其中Helper DNA的链长度为8～18碱基。用1 cm光路比色皿在235～320 nm范围内测定圆二色光谱，平均扫描3次，扫描速度为100 nm/min，响应时间为1 s，带宽为0.1 nm。

2.7 实际样品中T4 PNK及回收率检测

选择Hela细胞系和HEK 293细胞系作为实际样本。所有细胞均用含10%小牛血清的RPMI1640培养。每次实验的细胞数量为106个，通过液氮和37℃水浴中反复冻融3次，离心去除上层清液后，用1 mL PBS缓冲液洗3次，离心（10000 g，20 min）后，取上清液作为实际样品，不需稀释，取0.5 μL用于2.2节的实验。

向实际的细胞样品中添加0.05，0.1和0.2 U/mL的T4 PNK酶，进行酶活力检测，计算回收率。

3 结果与讨论

3. 1 传感器的设计原理

PS5.M在K+存在下可以形成G-四链体结构，与Hemin作用后形成具有过氧化物酶性质的复合物，可以催化H2O2氧化ABTS的反应，使溶液变色，在418 nm处吸光度值增加。本研究设计的检测T4 PNK的传感器中使用了3条寡核苷酸链（图1，链S1OH，S2OH和SH），其中链S1OH与链S2OH为PS5.M的分段序列，而SH的序列则部分与PS5.M互补。

利用T4 PNK酶将链S2OH的5′-端磷酸化为链S2P，再与链S1OH和链SH杂交形成双链结构，通过T4 DNA 连接酶的催化作用将S2P的5′端与S1OH的3′端相连接，得到PS5.M与SH的部分双链DNA结构。但是这种双链结构下的PS5.M不能有效形成G-四链体结构，所以引入核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ），可以从3′凹陷末端切掉链SH，将PS5.M链释放出来。最后，K+存在下，PS5.M与Hemin形成复合物，具有类过氧化物酶活性，催化H2O2氧化ABTS反应，形成的产物在418 nm处有最大吸收，通过检测体系的吸光度就可以实现对T4 PNK的检测。

T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）：核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）：T4 DNA 连接酶（T4 DNA ligase）；血红素（Hemin）。

为了验证T4 PNK 传感器的可行性，对不同的体系进行了在Hemin和K+存在下催化H2O2氧化ABTS的反应，将体系的吸光度变化进行了比较研究，结果见图2。

其中对照样品（a）是未添加任何DNA的条件下，测量体系的吸收光谱。图2中曲线d和e的结果表明，上述设计的由“分段”到“完整”转化的G-四链体DNA酶的传感器，在T4 PNK为5.0 U/mL时，释放的PS5.M的催化效果为同浓度PS5.M的催化效果的95.38%。当只有链S1OH和链S2OH时，在与Hemin作用后，体系的吸光度值大于只有Hemin存在时的情况，但是其催化效果不到同浓度PS5.M的30%。这是因为两条链也可以形成分子间的G-四链体结构，但是在S1OH，S2OH与SH杂交后，则很难形成分子间的G-四链体结构，这样可以有效降低背景信号。通过PNK磷酸化链S2OH，再与S1OH和SH杂交后，由T4 DNA连接酶连接，再通过Exo Ⅲ酶切掉Helper DNA 释放PS5.M链后，体系的吸光度明显增加，基于此可以检测T4 PNK酶的活性。

3.2 Helper DNA的选择

根据检测原理，检测时需保证T4 DNA 连接酶的连接效率以及Exo Ⅲ的剪切效率，而Helper DNA即SH的长度会影响上述两种酶的反应效率。实验考察了Helper DNA的长度与传感器响应信号的关系，结果见图3。

本研究考察的SH的碱基个数为8～18之间，并且与PS5.M序列中一部分碱基互补。图3的结果表明，当SH的碱基数为8和10时，体系的吸光度较低，这由于DNA的杂交效率低，从而导致T4 连接酶的效率不高。当链SH碱基个数大于12后，T4连接酶效率明显提高，最终选择14个碱基数的链5H14作为Helper DNA 进行后续实验。

根据文献＼[23＼]报道，如果形成的G-四链体的结构为平行构型时，在265 nm附近有一个正峰，在245 nm附近有一个负峰；而双链DNA的CD光谱在245 nm附近有一个负峰，但是正峰的位置在260～280 nm，具体会随序列不同而变化。对比圆二色光谱（CD）数据（图4）与吸光度数据（图3）可知，当Helper DNA碱基数为8或10时，体系中形成的G-四链体的结构的DNA很少，但是当链Helper DNA碱基数为14时，在体系中很好地形成并释放出PS5.M，在Hemin与K+存在下，形成了G-四链体结构。

3.3 PNK反应中ATP用量的优化

ATP是T4 PNK催化DNA5′-端磷酸化的反应物之一，其用量也会影响最终检测的灵敏度，所以对ATP浓度进行了优化。从图5可见，随着ATP浓度的增加，体系的吸光度迅速增加；当ATP浓度高于1 mmol/L后，吸光度增加缓慢，趋于平衡。所以在后续实验中选用1 mmol/L ATP。

3.4 传感器用于检测PNK

为了考察上述基于“分段”-“完整”G-四链体脱氧核糖核酸酶传感器对T4 PNK活性的定量检测的可行性，考察了不同浓度的T4 PNK酶与链S2OH反应，反应时间均为30 min。将反应得到的样品进行上述杂交、T4 连接酶连接、Exo Ⅲ酶剪切和与Hemin作用催化H2O2氧化ABTS的反应，测量体系在418 nm处吸光度的变化。如图6所示，在0.02～0.3 U/mL浓度范围内，体系在418 nm处的吸收值与T4 PNK 的浓度呈良好的线性关系，线性方程为y=0.6382x+0.3117 （R2=0.9945），检出限为0.014 U/mL（S/N=3），与文献＼[24＼]报道的结果相当。

3.5 传感器用于检测实际样本中PNK

为了检验此传感器对实际样品的检测效果，对Hela细胞系和HEK 293细胞进行处理，测量了样本中的T4 PNK酶的含量及加标回收率，结果见表1。Hela和HEK 293细胞裂解液中均含有PNK 酶。采用本方法测得两种细胞样品PNK酶的浓度分别为0.0596和0.0271 U/mL，两种细胞液中3个 浓度添加水平的PNK的回收率为95.6%～105.7%， 表明本方法可以用于实际样品中PNK活性的检测。

在K+存在下，G-四链体脱氧核糖核酸酶可与Hemin形成具有过氧化物酶性质的复合物，可以催化H2O2氧化ABTS反应，增强溶液的吸光度，据此构建了T4 PNK活性检测的传感器。本传感器设计巧妙，使用的寡核苷酸链无需标记，无需昂贵的仪器，实现了对T4 PNK酶的定量检测，可望用于实际样本中PNK的选择性的灵敏检测。

References

1 Richardson C C. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1965， 54： 158-165

2 Wang L K， Shuman S. Nucleic Acids Res.， 2002， 30： 1073-1080

3 Cameron V， Uhlenbeck O C. Biochemistry， 1977， 16： 5120-5126

4 Wang L K， Shuman S. J. Biol. Chem.， 2001， 276， 26868-26874

5 Tang Z， Wang K， Tan W， Ma C， Li J， Liu L， Guo Q， Meng X. Nucleic Acids Res.， 2005， 33： e97-e97

6 Song C， Zhao M. Anal. Chem.， 2009， 81： 1383-1388

7 Lin L， Liu Y， Zhao X， Li J. Anal. Chem.， 2011， 83： 8396-8402

8 Huang Y， Chen J， Shi M， Zhao S， Chen Z F， Liang H. J. Mater. Chem. B， 2013， 1： 2018-2021

9 Hou T， Wang X， Liu X， Pan C， Li F. Sens. Actuators B， 2014， 202： 588-593

10 Robertson D L， Joyce G F. Nature， 1990， 344： 467-468

11 Breaker R R， Joyce G F. Chem. Biol.， 1994， 1： 223-229

12 Cuenoud B， Szostak J W. Nature， 1995， 375： 611-614

13 SONG Lu-Na， ZHANG Yong-Hua， BO Hong-Yan， GAO Qiang. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（9）： 1402-1407

宋璐娜， 张永花， 薄红艳， 高 强. 分析化学， 2015， 43（9）： 1402-1407

14 DUAN Na-Na， WANG Na， YANG Wei， KONG De-Ming. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（10）： 1414-1420

段娜娜， 王 娜， 杨 薇， 孔德明. 分析化学， 2014， 42（10）： 1414-1420

15 Huppert J L. FEBS J.， 2010， 277（17）： 3452-3458

16 Lipps H J， Rhodes D. Trends Cell Biol.， 2009， 19（8）： 414-422

17 Jiang H， Kong D， Shen H X. Biosens. Bioelectron， 2014， 55： 133-138

18 Jiang C， Yan C， Jiang J. Anal. Chim. Acta， 2013， 766： 88-93

19 Li T， Wang E， Dong S. Anal. Chem.， 2010， 82（4）： 1515-1520

20 Aleman-Garcia M A， Orbach R， Willner I. Chem-Eur J.， 2014， 20（19）： 5619-5624

21 Xiao Y， Pavlov V， Niazov T， Dishon A， Kotler M， Willner I. J. Am. Chem. Soc.， 2004， 126（24）： 7430-7431

22 Travascio P， Li Y， Sen D. Chem. Biol.， 1998， 5： 505-517

23 Nagatoishi S， Tanaka Y， Tsumoto K. Biochem. Biophys. Res. Commun， 2007， 352： 812-817

24 He H Z， Leung K H， Wang W， Chan D S， Leung C H， Ma D L. Chem. Commun， 2014， 50： 5313-5315