重庆地区127例非小细胞肺癌患者EGFR基因突变分析

[摘要]目的研究重庆地区非小细胞肺癌（NSCLC）患者表皮生长因子受体（EGFR）基因突变情况。方法收集127例NSCLC患者不同来源的标本，提取DNA，采用扩增组织突变系统（ARMS） PCR法检测样品中EGFR基因18、19、20及21外显子的常见29种突变，并进一步分析其突变与临床特征的关系。结果 127例NSCLC肺癌患者中，EGFR突变患者56例，阳性率为44.1%。突变以19号外显子缺失突变以及21号外显子L858R突变为主，占85.7%。样本来源方面，胸水（16/28 57.1%）和新鲜组织（10/18 55.6%）阳性率最高。女性患者突变率67.9%（36/53）高于男性27.0%（20/74），（P

肺癌是威胁人类健康的主要恶性肿瘤，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌的80%以上。能够手术的非小细胞肺癌预后相对较好，但仍有30%左右早期肺癌在5年内死亡[1]。早期肺癌缺乏特异的临床症状而很难被发现，大部分患者被发现时已属中晚期，失去了手术根除的机会，而以铂剂为基础的常规化疗无法对中晚期无法获得长期疗效，预后极差[2]。

自1982年酪氨酸激酶家族被发现后，表皮生长因子受体（epidermal growth factorreceptor， EGFR） 作为该家族的一个代表成员广受关注，它的异常表达和活化在肺癌的发生、发展中起着重要的作用[3]。针对EGFR的靶向药物，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）如：西妥昔单抗（cetuximab）、吉非替尼（gefitinib）、厄洛替尼（erlotinib）等开始用于治疗NSCLC。但在临床应用中发现，TKI治疗的有效率仍不尽人意。2004年，两个研究均证明了EGFR基因激酶区的突变与NSCLC患

者对TKI类药物的反应密切关系 [4，5]。因此通过患者EGFR基因检测指导临床TKI类靶向药物的应用，筛选合适的患者，可显著提高药物疗效，并减少不敏感患者的资源浪费。本研究检测了重庆地区127名NSCLC患者不同标本类型EGFR基因突变情况，并分析其与患者临床特征的关系。

1 材料与方法

1.1 标本收集重庆医科大学附属第一医院临床分子医学检测中心2011年5月至2013年7月NSCLC患者标本127例，以及患者的临床资料。标本来源： 石蜡切片29例，新鲜组织18例，纤支镜抽吸物36例，胸水28例，痰11例，淋巴结2例，心包积液2例，腹水1例。各类标本均由两名病理医生根据WHO肺肿瘤组织学分型诊断确认。其中，男性74例，女性53例，男女比例1.4：1，中位年龄63（20-86）岁。

1.2 DNA提取石蜡组织运用二甲苯脱蜡后，用厦门艾德AmoyDxFFPE DNA分离试剂盒（离心柱型）提取DNA。非石蜡组织用厦门艾德AmoyDx组织样品DNA分离试剂盒（离心柱型）提取DNA。以Nano-100分光光度计测定提取后DNA的纯度及浓度。

1.3 EGFR基因突变分析采用扩增组织突变系统PCR法（amplification refractory mutation system，ARMS-PCR）法检测EGFR基因18、19、20 及21外显子的常见29种突变。试剂盒采用厦门艾德AmoyDx人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒。石蜡切片样品DNA浓度稀释到1.5～2ng/L，非石蜡切片样品DNA浓度稀释到0.4～0.6ng/L。反应循环参数： 95℃ 5min，1个循环； 95℃ 25s，64℃ 20s， 72℃20s， 15个循环； 93℃ 25s， 60℃ 35s，72℃ 20s，31个循环。按照试剂盒说明书判定检测结果。为保证质量控制，每批测定均带有1个阴性对照和1个阳性对照，阴性对照为ddH2O，阳性对照为质量稳定的经序列测定确定突变型的阳性标本。

1.4 统计学方法采用SPSS 13.0 软件进行χ2检验以及方差分析

2 结果

2.1 EGFR各位点突变率及突变类型

127例NSCLC患者中，EGFR突变患者56例，阳性率为44.1%。其中19号外显子缺失突变（19-Del）27例；21号外显子突变23例，其中21例为L858R突变，2例为L861Q突变；18号外显子突变3例，2例为G719X突变，1例为G719X、S768I双突变；20号外显子突变（T790M、20-Ins）1例，为T790M突变。除上述1例双突变外，还有2例患者存在双突变，1例为19号外显子19-Del突变和18号外显子S768I突变，1例为19号外显子19-Del突变和20号外显子T790M突变。

2.2 EGFR突变率与标本类型的关系

这127例NSCLC患者EGFR检测的样本来源，石蜡切片29例，突变阳性13例，阳性率44.8%；新鲜组织18例，阳性10例，阳性率55.6%；纤支镜抽吸物36例，EGFR突变阳性13例，阳性率36.1%；胸水28例，阳性16例，阳性率57.1%；痰11例，阳性2例，阳性率18.2%；淋巴结2例，1例阳性；心包积液2例，均为阴性；腹水1例，阳性。

2.3 EGFR突变与相关因素的关系

本组病例男性患者74例，女性患者53例，其EGFR基因突变率分别为27.0%（20/74）和67.9%（36/53），两者突变率有统计学差异（P

3 讨论

EGFR基因位于人类7号染色体短臂7p12-14区，有28个外显子。EGFR酪氨酸激酶ATP结合位点的编码区位于18-21号外显子，故此段区域与EGFR-TKIS治疗密切相关[5]。其突变主要有4种类型：19号外显子缺失突变，21号外显子点突变（L858R，L861Q），18号外显子点突变（G719X、S768I），和20号外显子插入突变（T790M、20-Ins）[6]。研究表明，EGFR基因突变主要为19号外显子缺失突变和21号外显子L858R突变，19、21、18号外显子突变改变了ATP结合槽周围的氨基酸序列，从而提高了肿瘤细胞对靶向药物的敏感性[7]。不同的突变类型对EGFR-TKIS治疗的有效率也不一样。在一次EGFR突变和TKI疗效的报告显示，19号外显子缺失的有效率为81%，21号外显子点突变的有效率为71%，18号外显子点突变的有效率为56%[6]。而20号外显子T790M突变，增加了EGFR和ATP的亲和力，阻碍了EGFR-TKIS与EGFR-TK区域的结合，而导致了获得性耐药[8]。T790M突变和MET基因突变是目前已知的EGFR-TKIs获得性耐药的两大主要分子机制[9]。另外，也有研究表明，T790M突变还可能与EGFR-TKIs原发耐药有关[10]。此次研究共收集127例NSCLC患者标本，运用ARMS-PCR方法检测EGFR基因18、19、20 及21外显子的常见29种突变。阳性突变率为44.1%。其中19号外显子缺失突变和21号外显子L858R突变48例，占85.7%。而且本次研究中，127例患者中有2例患者T790M突变，考虑患者可能对EGFR-TKIs耐药。

EGFR检测样本来源多种多样，127例标本包括石蜡切片29例，新鲜组织18例，纤支镜抽吸物36例，胸水28例，痰11例，淋巴结2例，心包积液2例，腹水1例。所有标本都经两名病理医生根据WHO肺肿瘤组织学分型诊断确认。从该研究可以看出，阳性胸水和新鲜组织的EGFR突变的阳性率最高，石蜡切片和总体的突变率相差不大，纤支镜抽吸物突变率其次，痰的阳性率较低，可能与纤支镜抽吸物和痰中肿瘤细胞较少有关。其余标本种类因例数太少，无法进行分析。因此，除大家公认的石蜡切片和新鲜组织以外，细胞学标本，如胸水、纤支镜抽吸物等也可以作为EGFR检测的样本来源。

研究表明，吉非替尼的有效人群大多为非吸烟的腺癌亚裔女性患者[11，12]。2004年首次报道了该抑制剂对EGFR基因发生突变的患者具有显著的疗效，同时非吸烟的腺癌亚裔女性患者更多发生EGFR突变。本次研究中，女性患者突变率高于男性，非吸烟者突变率高于吸烟者，腺癌突变率明显高于其他病理类型，与国内外既往研究相符[13]。但是由于样本量较少，检测后治疗效果以及耐药等未形成研究，这就需要更大样本的研究来支撑。

第一代EGFR-TKIs吉非替尼或者厄洛替尼进行的临床试验中，EGFR突变阳性患者反应率为55%-91%，无进展生存期以及肿瘤恶化时间约为7.7-13.3个月，而未进行EGFR检测的NSCLC患者反应率大大降低，为8.0-8.9%，中位生存期为2.2-3个月[14]。2011年NCCN非小细胞肺癌治疗指南中推荐EGFR-TKIs用于EGFR突变阳性的晚期患者。所以，通过EGFR基因检测筛选合适的用药人群是晚期肺癌患者靶向治疗的关键。

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