18份草珊瑚种质的ISSR标记遗传相关性与亲本选配分析

[摘要] 通过ISSR分子标记技术分析18份来源于不同产地并经质量评价的草珊瑚种质的遗传多样性及亲缘关系，并进行亲本选配优化分析，为进一步利用这些种质进行育种奠定一定基础。应用ISSR-PCR分子标记技术研究18个份来自于不同居群的草珊瑚种质的DNA指纹图谱，应用Popgen32软件计算遗传多样性和遗传距离， 并以UPCMA法进行聚类分析。经筛选获得23条多态性引物，ISSR-PCR扩增共获得198条谱带，其中多态性谱带184条，Nei′s基因多样性指数（h） 为0.32，Shannon多样性指数（I） 为0.485 4。供试的草珊瑚种质的遗传相似系数为0.383 8～0.878 8，平均为0.661 2。遗传距离分析揭示了各受试种质相互间的遗传一致性与遗传距离，其中种质S2与种质S18之间的遗传距离最远，为0.957 5，而种质S4与种质S5之间的遗传距离最近，仅为0.129 2。而聚类分析表明种质S1，S2，S3， S7，S10等5个种质在不同程度上有别于其余受试13个种质，并优化了S2与S3，S2与S6，S2与S18等3组较佳亲本选配组合。研究表明受试种质具有较好的遗传多样性，遗传距离分析与聚类分析所揭示的18个种质之间的亲缘关系，并为优化杂交育种的亲本选配提供遗传背景方面可靠的信息。

[关键词] 草珊瑚; ISSR; 遗传多样性; 亲缘关系，亲本选配

[收稿日期] 2014-05-29

[基金项目] 福建省教育厅A类项目（JA11138）;福建省科技重大项目（2011Y4005）

[通信作者] *梁一池，教授，博士生导师，主要从事中药材品质评价与质量标准研究，E-mail：

[作者简介] 魏艺聪，讲师，研究方向为中药生物技术，E-mail：

草珊瑚Sarcandra glabra是一种广谱中药材， 全株可入药， 具有很高的药用价值。《中国药典》2005 年版列为法定药材使用，还被广泛应用于保健品、食品、饮料及日用化工等方面，市场需求不断扩大，对草珊瑚原料需求也不断增加。近几年来， 草珊瑚野生资源急剧减少，收集优良种质，通过人工育种及人工栽培是保障草珊瑚资源可持续利用的必然要求[1-3]。药材的产量与品质性状属于数量性状，易受环境条件的影响，只根据性状表现进行种质选择效果不好，而有些性状虽受少数主基因控制，但也受遗传背景、微效基因等因素的影响。运用DNA指纹图谱的方法进行其遗传多态性研究可以从遗传背景分析种质材料之间的遗传差异和亲缘关系，从而确定种质之间的遗传距离，在杂交育种时指导亲本的选配，为杂种优势群的划分，减少杂交组合数，提高育种效率提供基因背景方面的依据[4-6]。利用分子标记，是进行药材品质性状选择的有效途径。

ISSR（inter-simple sequence repeat）即简单序列重复区间扩增多态性分子标记是近年来发展起来的十分有效的分子标记技术， 具有稳定、多态性高， 简便及易操作等优点，被视为理想的遗传标记方法[7-10]。

本研究利用ISSR分子标记技术对18个不同产地、不同品质性状的草珊瑚种质资源进行遗传多样性与亲缘关系研究，为进一步合理利用这些资源进行杂交育种或者分子辅助育种提供可靠的遗传背景信息。

1 材料

PCR 仪（Eppendorf，型号5332） ，电泳系统（ 北京市六一仪器厂，型号DYY-12） ，低温冷冻离心机（Eppendorf，型号5810R） ，凝胶成像分析仪（BIO-RAD ChemiDoc XRS），微量移液器（Eppendorf） 。

2×CTAB 提取液，1×TAE 缓冲液，琼脂糖（Promega公司） ，溴化乙锭（Fluka公司） ，Trans Start Top Taq DNA Polymerase（北京全式金公司），三氯甲烷无水乙醇异丙醇均为国产分析纯。

本研究实验样品是由福建中医药大学梁一池教授鉴定并收集的采自不同产地的18批样品，为金粟兰科植物草珊瑚，集中种植于福建中医药大学时珍园，本课题组已通过HPLC特征指纹图谱分析方法对这18个草珊瑚样品的7个活性成分进行了分析[11]，并按优、良、中与差把18个样品进行了分级，并进行了随机的编号（表1）。

表1 18份实验材料概况

Table 1 Basic information of 18 materials

No.原产地 （经度/纬度）品质等级

S1118°12′/26°58′低

S2118°17′/26°64′中

S3118°29′ /25°32′中

S4118°17′/25°05′中

S5114°71′/23°74′低

S6117°45′/26°25′高

S7119°32′/26°17′低

S8114°94′/25°80′低

S9116°50′/25°31′中

S10117°45′/ 26°17′低

S11117°35′/26°33′低

S12116°77′/25°70′中

S13117°55′/30°00′中

S14117°30′/24°35′低

S15117°41′/25°29′低

S16118°97′/25°85′低

S17118°13′/27°33′低

S18119°06′/26°08′中

2 方法

2.1 草珊瑚基因组DNA 的提取和纯化 采取受试18个草珊瑚种质各3个植株的嫩叶，采用经本研究室改良的CTAB 法分别提取这18个草珊瑚种质幼嫩叶片的基因组DNA， 以1%琼脂糖凝胶电泳检测。并纯化所提取的样品DNA。

2.2 多态性ISSR 引物筛选及参试材料的ISSR 分析 以18个样品的基因组DNA为模板， 对100条ISSR引物（UBC801～UBC900，购自上海生工生物技术有限公司）进行多态性筛选。在冰上建立20 μL的ISSR-PCR 反应体系：50 ng模板DNA，0.2 mmol・L-1 dNTPs，2.5mmol・L-1Mg2+，1.0 U Taq DNA 聚合酶、0.4 μmol・L-1引物。ISSR-PCR 扩增程序为94 ℃预变性5 min; 94 ℃ 45 s， 31～50 ℃ 1.5 min， 72 ℃ 1.5 min， 35 个循环; 72 ℃ 10 min; 10 ℃保存。退火温度因扩增产物的效果而调整。PCR 产物经1.8%的琼脂糖凝胶电泳分离， EB 染色检测。然后对18份草珊瑚样品进行标记分析， 获得扩增谱带。

2.3 数据统计及分析 PCR产物经电泳后，根据在凝胶同一迁移位置上DNA 条带的有无进行统计，有条带记为“1”，无条带记为“0”，形成0 /1 矩阵。应用Popgen32 软件进行遗传参数分析，计算了有效等位基因数（Na） ，等位基因数（Ne） ，Nei′s 基因多样性（He） ，Shannon′s 信息指数（Ho） ，Nei′s 遗传距离（D） 和遗传相似性（I） ，应用NTSYSpc2.1软件采用Nei′s 遗传距离进行UPGMA 分析，建立聚类图谱。

3 结果与分析

3.1 草珊瑚DNA 提取与ISSR-PCR分析 采用经本实验室改良的CTAB法提取草珊瑚叶片的基因组DNA并纯化，并用本实验室已建立的ISSR-PCR体系，以受试18个草珊瑚样品的基因组DNA为模板，从UBC801～UBC900等100个ISSR引物中筛选出23个扩增效果好的ISSR引物（表2），该表的部分结果已另文发表[12]。每个引物扩增条带数在5～15条，片段大小在200～2 000 bp （图1）。共扩增出198条谱带，平均每个引物扩增出8条谱带，其中多态性谱带184条，多态性条带比率为92.9%，表明受试样品在DNA水平上差异显著。

3.2 草珊瑚种质的遗传分化水平分析 根据ISSR-PCR扩增所得带谱整理形成0 /1 矩阵的数据文件，使用Popgen32软件分析受试草珊瑚样品的基因多样性。18个受试样品的平均观察等位基因数与平均有效等位基因数分别为1.959 6，1.531 7，平均有效等位基因数小于平均观察等位基因数，表明等位基因分布不均匀，但差异并不大（差异值0.42）。而Nei′ s 基因多样性指数（h）为0.32，Shannon 多样性指数（I）为0.485 4，表明受试样品具有一定的遗传多样性。

3.3 草珊瑚种质的遗传距离与聚类分析 使用Popgen32软件分析受试样品的Nei′s 遗传相似度与遗传距离（表3）。该表列出了所有受试草珊瑚种质相互之间的遗传相似系数与遗传距离，18个受试种质遗传相似系数处在0.383 8～0.878 8，平均遗传相似系数为0.661 2。种质S2与种质S18之间的遗传距离最远，达0.957 5。而种质S4与种质S5之间的遗传距离最近，仅为0.129 2。

表2 23条ISSR引物扩增条带数与多态性比率

Table 2 Number and ratio of polymorphic bands amplified by 23 ISSR primers

引物 引物序列 （5′-3′）退火温度/℃ 扩增条带数多态性条带数多态性比率/%

UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGT4888100.0

UBC810GAGAGAGAGAGAGAGAT4865 83.3

UBC811GAGAGAGAGAGAGAGAC4987 87.5

UBC815CTCTCTCTCTCTCTCTG4999100.0

UBC816CACACACACACACACAT4777100.0

UBC822TCTCTCTCTCTCTCTCA4866100.0

UBC824TCTCTCTCTCTCTCTCG4877100.0

UBC825ACACACACACACACACT481513 86.7

UBC827ACACACACACACACACG481313100.0

UBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYT4966100.0

UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT4999100.0

UBC841GAGAGAGAGAGAGAGAYC5054 80.0

UBC842GAGAGAGAGAGAGAGAYG5063 50.0

UBC844CTCTCTCTCTCTCTCTRC5166100.0

UBC847CACACACACACACACARC511010100.0

UBC848CACACACACACACACARG51109 90.0

UBC865CCGCCGCCGCCGCCGCCG701515100.0

UBC895AGAGTTGGTAGCTCTTGATC491111100.0

UBC831ATATATATATATTYA3155100.0

UBC861ACCACCACCACCACCACC5696 66.7

UBC881GGGTGGGGTGGGGTG561413 92.9

UBC891HVHTGTGTGTGTGTGTG4654 80.0

UBC900ACTTCCCCACAGGTTAACACA5288100.0

M.DNA Marker;C1.阴性对照;C2.阳性对照;S1～S18.草珊瑚样品。

图1 18个草珊瑚UBC825 引物扩增

Fig.1 Amplification results of primer UBC825 in18 Sarcandra glabra resources

利用NTSYSpc2.1软件进行UPGMA 聚类，得到树状聚类图（图2），结果表明来源于种质S1与S2聚在一起，在遗传相似系数为0.57处，分支于其余16个种质。而这16个种质中，种质S3在遗传相似系数为0.72处分支于其他15个种质，剩余15个种质中，种质S7与S10聚在一起，在遗传相似系数为0.74处分支于其余13个种质。而剩余13个种质的遗传相似系数达0.8以上。

3.4 草珊瑚种质的亲本选配分析 以上聚类分析表明种质S4～6，S8，S9，S11～18等13个草珊瑚种质的遗传相似性很高，达系数达0.8以上，在亲本选配时，药材品质属于同等级亲本中只需选择其一进行选育即可，可避免重复选育。而S1，S2，S3，S7，S10等5个种质在不同程度上有别于其余受试13个种质，在18个受试种质中具有一定的遗传特异性，可在该5个种质相互之间，或与其余13个种质之一间进行选配，结合各种质的药材品质评价等级及相互间的遗传距离，及远源杂交的杂种优势原理，亲本的药材品质等级属于中级选配中级的组合中，可选择S2与S18，S2与S3等2个组合，其亲本间的遗传距离分别达0.957 5，0.745 0，且S3与S18间的遗传距离0.745 0，表明这2组组合在遗传上属异质的杂交组合。而中级选配高级的组合中，可选择S2与S6间，他们之间的遗传距离达0.734 4。

4 小结与讨论

本研究只选取清晰可辩的ISSR-PCR扩增条带进行统计分析，以确保分析结果的可靠性，但是由于

表3 Nei′s遗传相似性和遗传距离

Table 3 Nei′s genetic identity （above diagonal） and genetic distance （below diagonal）

项目S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17S18

S1-0.686 9 0.575 8 0.596 0 0.575 8 0.601 0 0.626 3 0.611 1 0.590 9 0.535 4 0.611 1 0.606 1 0.616 2 0.641 4 0.631 3 0.469 7 0.474 7 0.444 4

S20.375 6 -0.474 7 0.505 1 0.484 8 0.479 8 0.545 5 0.540 4 0.530 3 0.505 1 0.530 3 0.596 0 0.555 6 0.580 8 0.540 4 0.449 5 0.454 5 0.383 8

S30.552 1 0.745 0 -0.747 5 0.757 6 0.732 3 0.656 6 0.722 2 0.722 2 0.676 8 0.752 5 0.757 6 0.767 7 0.691 9 0.742 4 0.449 5 0.474 7 0.474 7

S40.517 6 0.683 1 0.291 1 -0.878 8 0.843 4 0.767 7 0.813 1 0.813 1 0.767 7 0.792 9 0.767 7 0.808 1 0.853 5 0.792 9 0.500 0 0.545 5 0.545 5

S50.552 1 0.723 9 0.277 6 0.129 2 -0.873 7 0.747 5 0.823 2 0.803 0 0.707 1 0.813 1 0.737 4 0.818 2 0.813 1 0.813 1 0.500 0 0.545 5 0.535 4

S60.509 1 0.734 4 0.311 5 0.170 3 0.135 0 -0.803 0 0.828 3 0.808 1 0.732 3 0.787 9 0.732 3 0.792 9 0.787 9 0.838 4 0.525 3 0.540 4 0.550 5

S70.468 0 0.606 1 0.420 7 0.264 4 0.291 1 0.219 4 -0.752 5 0.691 9 0.777 8 0.681 8 0.697 0 0.707 1 0.732 3 0.772 7 0.540 4 0.535 4 0.535 4

S80.492 5 0.615 4 0.325 4 0.206 9 0.194 5 0.188 4 0.284 3 -0.808 1 0.792 9 0.848 5 0.792 9 0.803 0 0.787 9 0.818 2 0.484 8 0.510 1 0.530 3

S90.526 1 0.634 3 0.325 4 0.206 9 0.219 4 0.213 1 0.368 3 0.213 1 -0.681 8 0.787 9 0.782 8 0.823 2 0.798 0 0.777 8 0.494 9 0.510 1 0.489 9

S100.624 8 0.683 1 0.390 4 0.264 4 0.346 6 0.311 5 0.251 3 0.232 0 0.383 0 -0.742 4 0.727 3 0.747 5 0.732 3 0.732 3 0.520 2 0.535 4 0.575 8

S110.492 5 0.634 3 0.284 3 0.232 0 0.206 9 0.238 4 0.383 0 0.164 3 0.238 4 0.297 8 -0.782 8 0.803 0 0.767 7 0.798 0 0.505 1 0.520 2 0.520 2

S120.500 8 0.517 6 0.277 6 0.264 4 0.304 7 0.311 5 0.361 0 0.232 0 0.244 8 0.318 5 0.244 8 -0.818 2 0.762 6 0.782 8 0.500 0 0.525 3 0.494 9

S130.484 2 0.587 8 0.264 4 0.213 1 0.200 7 0.232 0 0.346 6 0.219 4 0.194 5 0.291 1 0.219 4 0.200 7 -0.803 0 0.843 4 0.489 9 0.515 2 0.494 9

S140.444 1 0.543 3 0.368 3 0.158 4 0.206 9 0.238 4 0.311 5 0.238 4 0.225 7 0.311 5 0.264 4 0.271 0 0.219 4 -0.818 2 0.484 8 0.489 9 0.510 1

S150.460 0 0.615 4 0.297 8 0.232 0 0.206 9 0.176 3 0.257 8 0.200 7 0.251 3 0.311 5 0.225 7 0.244 8 0.170 3 0.200 7 -0.545 5 0.550 5 0.560 6

S160.755 7 0.799 6 0.799 6 0.693 1 0.693 1 0.643 9 0.615 4 0.723 9 0.703 3 0.653 5 0.683 1 0.693 1 0.713 6 0.723 9 0.606 1 -0.833 3 0.813 1

S170.745 0 0.788 5 0.745 0 0.606 1 0.606 1 0.615 4 0.624 8 0.673 1 0.673 1 0.624 8 0.653 5 0.643 9 0.663 3 0.713 6 0.596 9 0.182 3 -0.848 5

S180.810 9 0.957 5 0.745 0 0.606 1 0.624 8 0.596 9 0.624 8 0.634 3 0.713 6 0.552 1 0.653 5 0.703 3 0.703 3 0.673 1 0.578 7 0.206 9 0.164 3 -

图2 基于ISSR 的18个受试草珊瑚样品Nei′s 遗传相似度UPGMA 聚类

Fig.2 UPGMA dendrogram of Sarcandra glabra based on Nei′s genetic distance

ISSR标记利用的是非特异引物，其扩增条带的稳定性是相对的，在ISSR分析时，可重复试验3次再把重复性好的条带纳入分析，可进一步提高结论的可靠性。本研究所用样本的药材品质均已通过高效液相色谱对草珊湖中反丁烯二酸、新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、异嗪皮啶、落新妇苷与迷迭香酸等7个已知化合物的含量测定的同时，对各成分的关系进行相关性分析，运用SPSS 19.0，通过pearson相关系数分析，发现绿原酸与反丁烯二酸，新绿原酸，隐绿原酸，落新妇苷及迷迭香酸的含量之间存在极显著正相关，并用SPSS 19.0软件对样品进行了主成分分析，采用组内平均数联结法，以欧式距离，进行系统聚类分析，将受试18个种质分为4个等级（优、良、中、差）作为质量评价参考。而本研究利用ISSR分子标记技术分析18个已经品质评价的草珊瑚种质资源的的遗传差异和亲缘关系，从而确定这些种质之间遗传距离，为指导利用这些种质进行杂交育种时的亲本选配，为提高育种效率提供可靠的遗传背景方面的依据，并优化了亲本选配的组合。本研究结果显示受试种质的多态性条带比率达92.9%，表明受试种质在DNA水平上具有广泛的差异。而Nei′s 基因多样性指数（h） 为0.32，Shannon 多样性指数（I） 为0.485 4，进一步表明受试种质的遗传多样性。受试18个种质之间的地理位置的距离差异不大，而且福建是草珊瑚的主产区之一，具有较多的草珊瑚种质资源，且所分析的18份种质之中仅有2份种质不是来源福建省，因此遗传距离分析揭示了受试的18份种质中来源于同一省份的S2与S18遗传距离较远，有一定的可信度。而聚类分析表明种质S1，S2，S3， S7，S10等5的种质在不同程度上差异于其余受试13个种质，在18个受试种质中具有一定的遗传特异性。另外，由于ISSR标记利用的是非特异引物， 其扩增条带的稳定性是相对的，分析结果具有一定的相对性，可结合其他分子标记技术进一步探讨研究。以上结果为杂交育种时亲本选择提供了遗传背景方面的依据，可结合药材有效成分含量方面的研究结果，将为进一步利用这些资源进行杂交育种或分子辅助育种奠定一定的基础。

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Genetic relationship and parent selection of some Sarcandra

glabra resources based on ISSR

WEI Yi-cong1， CHEN Ying2， LUO Lin-quan1， YANG Qun-xiong1， CHEN Yi-juan1， LIANG Yi-chi1*

（1.College of Pharmacy， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122， China;

2. College of Landscape Architecture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fouzhou 350002， China）

[Abstract] The study is aimed to assess the genetic diversity and genetic relationship of 18 Sarcandra glabra resources from different populations，and guide parent selection of cross breeding between these resources. The molecular marker technique ISSR was used to investigate the genetic diversity of the 18 resources.Data was analyzed by POPGEN 32，and a cluster diagram was presented by UPGMA.One hundred and ninety-eight amplified fragments were obtained using 23 ISSR primers.One hundred and eighty-four polymorphic loci were identified.Nei′s genetic diversity index （h） was 0.32，Shannon diversity index （I） was 0.485 4. The genetic similarity coefficient among the resources ranged from 0.383 8 to 0.878 8 in an average of 0.661 2.The genetic distance between sample S2 and sample S18 was the farthest， so as between sample S3 and sample S18 both Nei′s genetic distance was 0.957 5， The genetic distance between sample S4 and sample S5 was the closest， the Nei′s genetic distance was 0.129 2，and the sample S1，S2，S3，S7，S10 were significantly different from the others based on the clustering analysis，the three groups S2 vs S3，S2 vs S6，S2 vs S18 were the best parent group selection. There was a middle level of genetic differentiation in the resources. The genetic distance between resources gives useful information to guide parent selection of cross breeding.

[Key words] Sarcandra glabra; germplasm resource; genetic distance; cluster analysis; parent selection

doi：10.4268/cjcmm20142318