葛根芩连方中多成分肠渗透性的原药材归属研究

[摘要] 中药生物药剂学分类系统（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）构建的复杂层面为中药复方研究，在坚持多成分同时测定的前提下，开展渗透性研究时，其首要任务是明确透过肠壁而被吸收的成分来源，即具体归属于中药复方中的哪味药材。该研究利用化学成分指纹图谱技术（chemical fingerprint），采用离体翻转肠囊实验技术对经典名方葛根芩连方中的肠渗透多成分进行直观来源归属，为下一步的肠渗透性定性及定量研究奠定基础。

[关键词] 中药生物药剂学分类系统;葛根芩连方;渗透性;离体翻转肠囊;多成分;化学成分指纹图谱

[收稿日期] 2014-07-18

[基金项目] 国家自然科学基金项目（81473362）;北京中医药大学创新团队发展计划项目（2011-CXTD-13）

[通信作者] *董玲，副研究员，硕士生导师，主要从事新剂型给药系统研究，Tel：（010）64286245，E-mail：;*刘洋，副教授，硕士生导师， 主要从事药物代谢研究，Tel：（010）84738629，E-mail：

[作者简介] 朱美玲，硕士研究生，E-mail：

中药生物药剂学分类系统的分类依据中，渗透性是重要指标之一，但因中药成分的复杂性，尤其是中药复方，需按照肠渗透成分归属、肠渗透成分定性和肠渗透成分定量分析的过程，逐步阐述。为坚持中药多成分整体性研究的原则，利用化学成分指纹图谱技术，运用单味药材和复方交叉对比的方法，开展肠渗透多成分的原药材归属研究是可行的。肠渗透性实验方法很多，通过前期的实验方法研究，因离体外翻肠囊法的多成分指纹图谱直观性最优，而被选中。该方法最初是由Wilson和Wiseman于1954年创建[1]，具有直接、快速反映吸收行为，可控、简便调整实验条件的优势，虽定量准确性稍差，但却是研究锁定吸收成分的有效手段。葛根芩连方是源于《伤寒论》的经典名方，由葛根、甘草、黄芩和黄连组成。目前对于其药效成分和质量控制具有广泛而深入的研究报道[2-3]，但对于其整体的多成分肠渗透性却未见文献报道。因此本研究对葛根芩连方进行实验，探索其组方各味药材的主要成分在葛根芩连方的多成分环境下，是否可以被吸收，从而为下一步的多成分肠渗透性定性和定量分析提供基础支撑。

1 材料

1.1 仪器

Waters液相色谱系统（600四元泵，美国Waters公司）;2487双波长紫外检测器，Empower2工作站;电子分析天平（BT-25S，北京赛多利斯仪器有限公司）;超声波清洗器（KQ-500DE，昆山超声仪器有限公司）;电热恒温水浴锅（DZKW-4，北京中兴伟业仪器有限公司）。

1.2 药物

葛根、黄芩、黄连及甘草购买于北京同仁堂药店;葛根素对照品（批号110752-200912，中国食品药品检定研究院）;葛根素原料（批号120504，陕西中鑫生物技术有限公司）;黄芩苷原料（批号ZL-A-018，南京泽朗医药科技有限公司）;盐酸小檗碱原料（批号120212，陕西中鑫生物技术有限公司）;甘草酸单铵原料（批号GU20120611，武汉金诺化工有限公司）。

1.3 试剂

乙腈购买于美国Fisher公司（色谱级）;乙酸、三乙胺、磷酸、氯化镁、氯化钠、磷酸二氢钠、氯化钾、氯化钙、碳酸氢钠、葡萄糖购买于北京化工厂（分析级）;娃哈哈纯净水购买于娃哈哈集团公司（中国杭州）。

1.4 动物

Wistar大鼠，雄性，体重200～250 g，北京维通利华试验动物技术有限公司提供，许可证号 SCXK（京）2012-0001。

2 方法

2.1 葛根芩连方多成分色谱指纹图谱分析方法的建立

采用高效液相色谱法测定，参照相关文献[4]，色谱条件为：Thermo Scientific，Hypersil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流速1.0 mL・min-1;检测波长270 nm;柱温室温;进样量10 μL;缓冲溶液（1%三乙胺，1%乙酸，用磷酸调pH到3.0，A）-甲醇（B）进行梯度洗脱（0～12 min，76%A;12～13 min，76%～72%A;13～19 min，72%A;19～20 min，72%～66.2%A;20～37.5 min，66.2%A;37.5～38.5 min，66.2%～59%A;38.5～60 min，59%～25%A）。

2.2 葛根芩连方及其组方药材的离体翻转肠囊法多成分吸收定性研究

2.2.1 人工肠液的制备 称取葡萄糖0.7 g，氯化镁0.01 g，磷酸二氢钠0.16 g，氯化钠3.9 g，氯化钾0.175 g，氯化钙0.185 g，碳酸氢钠0.685 g，用蒸馏水定容于500 mL量瓶中，备用。

2.2.2 肠吸收药液的制备 称取复方中的各味药材研成粉末（全部过20目筛），取适量用50%甲醇超声提取1 h，时时振摇，将提取液浓缩至无甲醇味，加人工肠液制成一定浓度药液，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液供HPLC分析。

2.2.3 大鼠离体翻转肠囊模型实验方法 采用禁食不禁水12 h的健康大鼠，水合氯醛麻醉，小心将肠管同肠系膜剥离，分别取小肠10 cm，放入37 ℃的人工肠液中，冲洗至无内容物流出。小心剥离肠段表面的肠系膜和脂肪，将肠管一端结扎于自制塑料套管，小心将肠管翻转，向肠囊内注入1 mL空白人工肠液，结扎另一端，放入37 ℃恒温的药液中，通入氧气。孵育1 h后将肠囊取出，擦净表面液体，倾出液体。过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液供HPLC分析。

3 结果

3.1 葛根芩连方中各药材提取溶剂的考察

本研究前期发现葛根芩连方中各药材用加热回流提取与超声提取的化学多成分种类相似，无明显的峰数差异，但超声提取更方便，为更适合的提取方法。因此，本研究中各药材均采用超声提取的方法，对提取溶剂进行了考察。

分别平行精密称取3份葛根芩连方中各药材粉末，每份约3 g，置圆底烧瓶中，第1份加入50 mL甲醇，第2份加50%甲醇50 mL，第3份加入50 mL水，称定质量，超声处理1 h，时时振摇，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，再过0.45 μm滤膜，注入液相色谱仪。葛根提取溶剂的考察结果见图1，通过图谱对比可知，50%甲醇提取物所显现的化学成分种类信息量最大，为最适合的方法;纯甲醇与50%甲醇提取成分数量相当，但50%甲醇提取的含量更高;甲醇提取的含量效果在提取极性较小物质方面优于水提取。黄芩提取溶剂的考察结果见图2，通过图谱对比可知，50%甲醇和甲醇提取物所显现的化学成分种类信息量最大，均为适宜方法;甲醇提取的含量效果在提取极性较小物质方面优于水提取。黄连提取溶剂的考察结果见图3，通过图谱对比可知，50%甲醇、甲醇及水提取物所显现的化学成分种类类似，均为适宜方法。甘草提取溶剂的考察结果见图4，通过图谱对比可知，50%甲醇提取物所显现的化学成分种类信息量最大，为最适合的方法;纯甲醇与50%甲醇提取成分数量相当，但50%甲醇提取的含量更高;甲醇提取的含量效果在提取极性较小物质方面优于水提取。因此，本研究中各药材均采用50%甲醇进行超声提取。

A.甲醇提取液;B.50%甲醇提取液;C.水提取液（图2～4同）。

图1 葛根不同提取溶剂考察的HPLC图

Fig.1 The HPLC chromatograms of studies on Puerariae Lobatae Radix different extraction solvents

图2 黄芩不同提取溶剂考察的HPLC图

Fig.2 The HPLC chromatograms of studies on Scutellariae Radix different extraction solvents

图3 黄连不同提取溶剂考察的HPLC图

Fig.3 The HPLC chromatograms of studies on Coptidis Rhizoma different extraction solvents

图4 甘草不同提取溶剂考察的HPLC图

Fig.4 The HPLC chromatograms of studies on Glycyrrhizae Radix et Rhizoma different extraction solvents

3.2 葛根芩连方多成分色谱指纹图谱的建立

3.2.1 组方各药材的多成分色谱指纹 为研究指纹图谱中各峰的归属，取复方中的各位药材研成粉末，取适量用50%甲醇超声1 h，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，进样10 μL，见图5。

3.2.2 葛根芩连方多成分总体色谱指纹图谱及各峰的药材归属 葛根芩连方适量用50%甲醇超声1 h，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，进样10 μL，见图6。

3.3 葛根芩连方中肠渗透性多成分的药材归属

3.3.1 各药材多成分肠渗透性研究 甘草肠吸收定性分析结果见图7，从图谱中可以看出峰a，b，c，d，e没有被吸收，其他成分都有较好的吸收。黄芩的吸收定性分析结果见图8，从图谱可以发现，峰a，b，c，d，e，f，g没有被吸收。葛根吸收定性分析结果见图9，从图谱可看出，葛根的大部分成分都能吸收，但吸收的程度有差别。黄连肠吸收定性分析结果见图10，从峰位上看黄连的很多成分都能吸收。

A.黄芩;B.甘草;C.黄连;D.葛根。

图5 葛根芩连方各药材多成分指纹图谱

Fig.5 The affiliation of the multicomponent chromatographic fingerprint peaks in Gegen Qinlian decoction

A.黄芩中的成分;B.甘草中的成分;C. 黄连中的成分;D. 葛根中的成分。

图6 葛根芩连方多成分总体指纹图谱

Fig.6 The fingerprint of multicomponent in Gegen Qinlian decoction

3.3.2 葛根芩连方整体多成分肠渗透性研究 葛根芩连方整体多成分肠渗透性研究结果见图11，由图谱可知葛根芩连方中的原归属于各药材的主要吸

A. 药液;B. 肠吸收液（图8～11同）。

图7 甘草肠吸收成分指纹图谱

Fig.7 The HPLC chromatographic of Glycyrrhizae Radix et Rhizoma intestinal absorption components qualitative analysis

图8 黄芩肠吸收成分指纹图谱

Fig.8 The HPLC chromatographic of Scutellariae Radix intestinal absorption components qualitative analysis

图9 葛根肠吸收成分指纹图谱

Fig.9 The HPLC chromatographic of Puerariae Lobatae Radix intestinal absorption components qualitative analysis

图10 黄连肠吸收成分指纹图谱

Fig.10 The HPLC chromatographic of Coptidis Rhizoma intestinal absorption components qualitative analysis

收成分都可吸收，并且通过各药材肠吸收与葛根芩连方整体肠吸收的色谱峰对比（图7～11），可以将复方中可吸收成分归属到组方各药材中。

图11 葛根芩连方整体肠吸收多成分指纹图谱

Fig.11 The HPLC chromatographic of Gegen Qinlian decoction intestinal absorption components qualitative analysis

4 讨论

离体翻转肠囊法自提出后就因其简单可靠而得到了广泛的应用，为较好的药物吸收机制的快速评价方法[5]，还可用来分析复杂多成分药物的肠吸收轮廓[6]，有利于进一步探索吸收进入机体的药效物质基础化学成分。但通过离体翻转肠囊法与其他方

法的比较分析[7]，也发现了离体翻转肠囊法因需成分通过肠壁肌肉和浆膜层进入囊腔的过程相比于实际肠吸收来说更加困难的现实，所以此方法对于可吸收成分来说更加苛刻。同时因肠处于离体状态，缺乏血液循环和神经支配，相比于在体实验略显粗糙。但实验中，采用持续通入95%氧气和5%二氧化碳混合气体的方法来保持离体肠段活性。肠囊是否破损或者坏死的一项重要指标可以和多成分指纹图谱的特征充分结合起来，即如果原药材指纹图谱与肠囊内吸收液指纹图谱完全一致，说明全部成分都透过肠囊，几乎可以断定肠囊破损或者坏死了。

单一成分的吸收已经建立了多种较为成熟的研究模型，并且提出了明确的理论基础和研究方法。在复杂环境背景下单一成分的吸收不同于单一成分单独存在的情况，但一直以来，复杂体系下研究药物吸收评价方法和理论基础相对缺乏，并且缺少如何在复杂体系下通过选择不同的化学背景以改善药物的吸收的方法。而中药本身就是多成分体系，药物成分之间可能存在复杂的药物相互作用。葛根芩连方包含4味药材分别为葛根、甘草、黄芩和黄连。对于其中某一种或某几种有效成分的性质的研究已较为透彻[8-9]，但对于整体药材甚至全方的研究则相对薄弱。如果要将BCS生物药剂学分类引入中药多成分系统中，不可避免的要对BCS的2个重要参数溶解性和渗透性进行测定。而多成分复杂且微量的特点造成了不可能对每一个成分进行体内外实验。因此利用离体翻转肠囊法现行将复方中成分的原药材归属确定，有利于下一步的多成分肠渗透性定性定量研究。实际上作者已经完成并发表的葛根素肠渗透性研究的相关论文，就是建立在本文的研究方法前提下，确定了多成分环境下源于葛根药材的葛根素可被肠吸收后才开始的定量研究[10-11]。

[参考文献]

[1] Wilson T H， Wiseman G. The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface[J]. J Physiol，1954，123（1）：116.

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[3] 陈丽红，王强，刘济宁，等.葛根芩连配方颗粒标志性成分含量分析及指纹图谱研究[J].分析化学，2006，8（34）：1109.

[4] Chen L， Liu J. Fingerprint comparison between Gegen Qinlian preparations of three different pharmaceutical forms including decoction， dispensing granule and pill[J]. Chromatographia，2009，69（1）：123.

[5] 张英丰，李玉洁，杨庆，等.采用离体外翻肠囊模型进行穿心莲内酯的肠吸收特性研究[J].中国实验方剂学杂志，2010，16（9）：107.

[6] 刘晓颖，苏淇，甘晓玲，等.外翻肠囊法评价及比较5种药物大鼠肠透膜能力[J].中国药房，2009，20（22）：1704.

[7] Luo Z， Liu Y， Zhao B， et al. Ex vivo and in situ approaches used to study intestinal absorption[J]. J Pharmacol Toxicol Methods，2013，68（2）：208.

[8] 黄嗣航，龙晓英，袁飞，等.酚红法和改良重量法分别研究葛根素的大鼠在体肠吸收机制[J].广东药学院学报，2012，28（6）：1.

[9] 张力勤，黄应栋，杨秀伟.甘草苷和异甘草苷在Caco-2细胞单层模型中的肠吸收研究[J].中国药学：英文版，2010，6：451.

[10] Li H， Dong L， Liu Y， et al. Biopharmaceutics classification of puerarin and comparison of perfusion approaches in rats[J]. Int J Pharm，2014，466（1）：133.

[11] Li H， Dong L， Liu Y， et al. Comparison of two approaches of intestinal absorption by puerarin[J]. J Pharmacol Toxicol Methods，2014，70（1）：6.

Study of attribution of multicomponent original medicinal materials in

Gegen Qinlian decoction with intestinal permeability

ZHU Mei-ling， YANG Wen-ning， DONG Ling*， DONG Hong-huan， HOU Cheng-bo， LIU Yang*

（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] The complex level of constructing biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica（CMMBCS） was the study of traditional Chinese compound， on the premise of insisting that the multicomponent simultaneous determination， when carrying out the study of intestinal permeability， the primary task was to define the source of the components that was absorbed through the intestinal wall， namely， which medicinal material the components belonged to in traditional Chinese compound. The technology of chemical fingerprint and in vitro everted gut sac model were used in this research to make multicomponent an intuitive source attribution which permeated the intestine in the classic formula Gegen Qinlian decoction， and to lay the foundation for the further qualitative and quantitative research of intestinal permeability.

[Key words] biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica; Gegen Qinlian decoction; permeability; in vitro everted gut sac; multicomponent; chemical fingerprint

doi：10.4268/cjcmm20142303