实验性自身免疫性重症肌无力大鼠干扰素-γ和白细胞介素-12水平变化的研究

【摘 要】目的 探讨干扰素（IFN）-γ和白细胞介素（IL）-12在实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）发病机制中的作用。方法 10只Lewis大鼠随机分为EAMG组和健康对照组。EAMG组采用AChR二次免疫的方法制作EAMG模型，观察大鼠EAMG症状。于初次免疫后第7周，对大鼠进行Lennon评分，采用酶联免疫吸附试验和RT-PCR方法分别检测大鼠脾脏T淋巴细胞IFN-γ和IL-12p35 mRNA的表达水平。结果 AChR二次免疫后，EAMG组大鼠产生了典型的EAMG症状。初次免疫后第7周，EAMG组大鼠Lennon评分及其脾脏T淋巴细胞IFN-γ和IL-12p35 mRNA的表达水平均显著高于健康对照组（P0.01）。结论 EAMG大鼠脾脏T淋巴细胞IFN-γ和IL-12的表达增强，提示IFN-γ和IL-12在EAMG的发病机制中具有重要作用。

【关键词】重症肌无力 干扰素-γ 白细胞介素-12

中图分类号：R746.1 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2011）7-057-03

【Abstract】Objective To investigate the effect of interferon(IFN)-γ and interleukin(IL)-12 on the pathogenesis of experimental autoimmune myasthenia gravis(EAMG). Methods 10 Lewis rats were divided randomly into EAMG group and normal control group.The EAMG mode were induced with the methods of AChR for 2 times in EAMG group, then the symptoms of EAMG were viewed. After 7 weeks of the first immunization, the symptoms of rats were scored as Lennon, the expression of IFN-γ and IL-12 of spleen T cells of rats were measured by the methods of enzyme-linked immunoadsordent assay or RT-PCR. Results The rats of EAMG group showed typical symptoms of EAMG after the second immunization, of which the Lennon score and the expression of IFN-γ and IL-12 of spleen T cells were higher significantly than the normal control group after 7 weeks of the first immunization (P0.01). Conclusions The expression of IFN-γ and IL-12 of spleen T cells of EAMG rats were enhanced, which suggested that IFN-γ and IL-12 play an important role in the pathogenesis of EAMG.

【Key words】Myasthenia gravis Interferon-γ Interleukin-12

重症肌无力（myasthenia gravis，MG）及其实验性自身免疫性重症肌无力（Experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG）是神经肌肉接头传递功能障碍的一种自身免疫性疾病。乙酰胆碱受体抗体(Acetylcholine receptor antibody, AChRab)介导的体液免疫和T细胞介导的细胞免疫是其主要发病机制，胸腺则是激活和维持MG自身免疫反应的重要因素，某些遗传及环境因素也与MG的发病密切相关。近年来国内外学者对细胞因子与MG的关系进行了大量研究，发现细胞因子网络失衡在MG发病机制中起重要作用。本研究通过制作大鼠EAMG模型，检测其T淋巴细胞干扰素（Interferon，IFN）-γ和白细胞介素（Interleukin，IL）-12的表达水平，从T淋巴细胞的功能状态来探讨IFN-γ和IL-12 在EAMG发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与动物 RPMI-1640培养基、胎牛血清、逆转录试剂盒、TRIZOL为美国Gibco公司产品。PCR Marker购自大连宝生物公司。细胞因子rrIL-4、rrGM-CSF、完全弗氏佐剂（CFA） 均为Sigma公司产品。大鼠IFN-γELISA检测试剂盒为R&D公司产品。乙酰胆碱受体（AChR）由本实验室提取。健康Lewis大鼠，雌性，6～8周龄，重约150g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 EAMG模型的制作 Lewis大鼠，随机分为EAMG组和健康对照组2组，每组5只。EAMG组采用AChR蛋白二次免疫的方法复制EAMG模型：用AChR蛋白与等量CFA的混合乳剂共1.5 ml分别于大鼠足垫、腹部及背部皮下多点注射，行初次免疫；初次免疫后第4周，同前方法行再次免疫。健康对照组不作任何处理。

1.3 EAMG症状评分 免疫后用盲法观察，按Lennon评分法行MG样症状评分：0分，没有无力表现；1分，轻度活动减少，抓握和嘶咬无力，容易疲劳；2分，活动明显减少和体重减轻，休息时身体呈隆起姿势，头尾下垂，大腿外展，前肢趾弯曲，活动时颤抖；3分，严重无力表现，无抓握和嘶咬动作，呼吸困难，濒死或死亡。

1.4 脾脏T淋巴细胞的分离与体外诱导 初次免疫后7周将大鼠处死，立即在无菌条件下取出脾脏，在RPMI-1640培养液中研磨使其通过不锈钢筛网，用Tris-NH4Cl缓冲液破坏红细胞，5 min后加入PBS洗涤细胞2次，以RPMI-1640重悬，37℃贴壁2h，收集上清未贴壁细胞，用RPMI-1640完全培养液重悬，加至预先已用RPMI-1640完全培养液浸湿的尼龙毛柱上37℃孵育30min后，冲洗出的细胞即为T淋巴细胞，以RPMI-1640完全培养液悬浮，调整浓度至2×106/mL后接种于24孔培养板，置37℃、5% CO2培养48h。收集培养上清液和细胞。

1.5 T淋巴细胞IFN-γ水平的检测 取各组细胞培养的上清液，以0.45μm的滤膜去除杂质后，采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoadsordent assay, ELISA)检测IFN-γ浓度。

1.6 T淋巴细胞IL-12p35 mRNA表达的检测 收集各组T细胞，用TRIZOL试剂提取细胞总RNA。在逆转录酶M-MLV的作用下，将mRNA逆转录成cDNA分子。然后通过PCR 扩增IL-12 p35和参照β-actin的cDNA。IL-12 p35的上游引物为：5′CGCTACCTCCTCTTCTTG 3′，下游引物为：5′GCTTTCTGGTGCAGA GTC 3′，扩增产物长度为500 bp。β-actin的上游引物为：5′AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA 3′，下游引物为：5′ATGCTGCTTAC ATGTCTCGAT 3′，扩增产物长度为266 bp。PCR总反应体积50μl。反应条件为: 94℃预变性5 min，94℃变性30 s, 48℃(β-actin为54℃)退火30 s,72℃延伸45 s,共进行32个循环,72℃加强延伸7 min。将10 μl 扩增产物于琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下观察电泳条带的灰度并摄像。用Quantity One软件分析各组光密度值。

1.7 统计分析 检测数据以“均数±标准差”（x±s）表示，两组之间的比较采用t检验。以α＝0.05为检验显著性水准。

表 1 第7周Lennon评分和T淋巴细胞IFN-γ、IL-12水平比较

（x±s，n=5）

注：与健康对照组比较 P0.01

2 结果

2.1 二组大鼠EAMG症状评分 见表1。在AChR和CFA初次免疫后1周左右，EAMG组大鼠有3只出现短暂的肌无力症状，评分1～2分，持续2～5 d大多自行缓解。在初次免疫4周后，EAMG组大鼠全部相继出现MG样症状，7周达到高峰，评分1～3分。健康对照组大鼠始终均无任何肌无力样症状，EAMG症状评分0分。第7周EAMG组的Lennon评分显著高于健康对照组（P0.01）。

2.2 二组大鼠T淋巴细胞IFN-γ水平比较 见表1。与健康对照组比较，EAMG组大鼠T淋巴细胞IFN-γ的表达水平显著增高（P0.01）。

A：健康对照组，B：EAMG组

图 1 T细胞β-actin mRNA 的表达

A：健康对照组，B：EAMG组

图 2 T细胞IL-12p35 mRNA 的表达

2.3 二组大鼠T淋巴细胞IL-12p35 mRNA水平比较 见表1、图1、图2。2组大鼠T淋巴细胞β-actin mRNA 表达水平恒定,无显明显差异,表明该检测方法可靠。与健康对照组比较，EAMG组大鼠T淋巴细胞IL-12p35 mRNA的表达水平显著增高（P0.01）。

3 讨论

机体免疫应答主要由B细胞和T细胞介导，T细胞应答则是机体对抗原产生免疫应答的关键环节。外周T细胞的激活和分化受遗传背景、TCR介导的信号强度、共刺激信号、细胞因子微环境及抗原提呈细胞的功能等影响。AChR特异性T细胞的活化及局部侵润、AChR抗体的产生及其对神经肌肉接头（NMJ）突触后膜AChR的攻击是MG器官特异性损伤的免疫学基础。因为T细胞的活化与分化受细胞因子微环境的影响，而AChR抗体的产生又通过细胞因子受T细胞调控[1]，故在MG异常自身免疫反应和MG耐受的发生过程中，细胞因子始终起着十分重要的作用。

IFN-γ主要由活化的Th1型T淋巴细胞产生，具有诱导MHC表达、激活巨噬细胞、决定T细胞归宿、促进B细胞增殖分化及上调其它细胞因子等多种免疫调节功能。IFN-γ在诱导B细胞成熟、辅助AChRab的产生并进而诱发MG临床症状和体征的过程中起重要作用，且可能是EAMG和MG的始发因子之一[2]。MG和EAMG体内IFN-γ诱导蛋白10及其受体表达增高，而阻断其信号转导可抑制EAMG发生[3]。用AChR加完全弗氏佐剂免疫Lewis大鼠诱导EAMG的同时，给予其重组大鼠IFN-γ皮下注射，结果诱导出的EAMG症状明显加重，AChRab和Th细胞水平也明显增高[4]。而用AChR免疫IFN-γ/IFN-γR缺陷的B6小鼠时，却不能诱导出肌无力的症状[5]。表达RelB质粒转染的未成熟DC可诱导EAMG耐受，同时抑制了IFN-γ的产生[6]。本研究发现，EAMG组大鼠T淋巴细胞IFN-γ的表达水平明显增高，提示IFN-γ在MG和EAMG的发病机制中具有重要作用。

IL-12是由分子量分别为35KD和40KD的两条链经2个二硫键共价结合而成的异二聚体糖蛋白，主要由活化的巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞产生，是最强的NK细胞激活因子，可促进CD4+ Th0细胞分化成Th1细胞，有致炎和免疫调节作用。给予外源性IL-12可显著提高EAMG易感鼠血清抗电镘AChR IgG2a抗体水平[7]；增加其病情严重度[8]。而当IL-12基因敲除鼠用电镘AChR免疫时，其血清电镘AChR特异性Th1细胞以及抗电镘AChR IgG2a抗体水平则明显降低，IL-12基因敲除鼠几乎没有显示出任何EAMG的神经生理证据，且AChR的减少也不明显[7]。给予抗IL-12抗体可增强口服耐受[9]。免疫抑制治疗可明显降低MG患者外周血单核细胞IL-12的分泌[10]。本研究发现，EAMG组大鼠T淋巴细胞IL-12的表达水平明显增高，提示IL-12在MG和EAMG的发生过程中亦起着十分重要的作用。

参考文献

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