柱后衍生-高效液相色谱-荧光检测法测定面粉中的过氧化苯甲酰

摘 要 利用过氧化苯甲酰能够在氯化血红素的催化下将底物对羟基苯乙酸氧化成具有荧光的二聚体的性质，建立了柱后衍生-高效液相色谱-荧光检测法测定面粉中过氧化苯甲酰的方法。优化了色谱分离条件和柱后衍生条件，结果表明： 催化剂氯化血红素的浓度为8

SymbolmA@ mol/L，底物对羟基苯乙酸的浓度为80

SymbolmA@ mol/L，衍生化试剂的pH 10.5，衍生温度为35 ℃时衍生效率最高。在优化条件下，过氧化苯甲酰的线性范围为0.5～100 mg/L；样品的检出限为1 mg/kg，样品的加标回收率为98.5%～99.5%。本方法与现有的高效液相色谱法相比，检测面粉中过氧化苯甲酰具有抗干扰能力强，灵敏度高。

关键词 柱后衍生；高效液相色谱；荧光检测法；过氧化苯甲酰

2011-07-28收稿；2011-09-30接受

本文系国家质量监督检验检疫总局科研计划项目（No. 2011IK217）资助

* E-mail: mam@nbciq.省略

1 引 言

过氧化苯甲酰（Benzoyl peroxide，BPO）是一种重要的有机过氧化物。由于BPO对小麦面粉具有后熟、增白等作用，长时间被用作面粉改良剂。然而，过氧化苯甲酰不仅能破坏面粉中的维生素A、E等营养成分，而且还会产生对人体有害的苯甲酸和苯酚等有害物质。2011年2月11日，卫生部联合六部委下发了《关于撤销食品添加剂过氧化苯甲酰、过氧化钙的公告（2011年 第4号）》，要求自2011年5月1日起，禁止在面粉中添加过氧化苯甲酰。

目前，过氧化苯甲酰的检测方法主要有高效液相色谱法[1～3]、毛细管电泳法[4]、气相色谱法[5]、间接碘量法[6]、紫外分光光度法[7,8]及静态注射化学发光法[9]等。高效液相色谱-荧光检测法测定某些有机过氧化物的方法已有报道，一般是采用辣根过氧化酶（HRP）[10,11]或氯化血红素（Hemin）[12,13]作为催化剂，以对羟基苯乙酸为底物测定有机过氧化物。然而，目前报道的这此类方法仅限于测定过氧化氢、过氧酸类的有机过氧化物等水溶性有机过氧化物，对过氧化苯甲酰的研究未见报道。本研究以氯化血红素为催化剂，对羟基苯乙酸为反应底物，采用柱后衍生-高效液相色谱-荧光检测法检测面粉中过氧化苯甲酰。由于该衍生反应具有一定的专属性，因此本方法与现有的高效液相色谱法相比，检测面粉中过氧化苯甲酰具有抗干扰能力强，前处理简单，灵敏度高等优点。2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Alliance e2695型高效液相色谱仪，配有2475型荧光检测器（美国Waters公司）； PINNACLE PCX型柱后衍生器（美国PICKERING公司）；S40K型pH计（瑞士Mettler公司）；甲醇和乙醇（色谱纯，迪马科技公司）；氯化血红素（分析纯，Sigma公司）；对羟基苯乙酸（98%，Acros公司）；过氧化苯甲酰、85% H3PO4、氨水（25%）、NH4Cl、冰乙酸（分析纯，国药集团）。

2.2 实验方法

2.2.1 衍生试剂的配制 2.68 g NH4Cl溶于200 mL水，加入30 mL 氨水，定容至500 mL；将2.6 mg氯化血红素和6.6 mg对羟基苯乙酸溶于500 mL上述缓冲溶液中，即得柱后衍生试剂。

2.2.2 色谱条件 色谱柱为SunFireTMC18柱（250 mm×4.6 mm×5

SymbolmA@ m），流动相为含有0.1%乙酸的甲醇-水（85∶15, V/V）体系，流动相在使用前用0.45

SymbolmA@ m滤膜过滤，流速为0.6 mL/min，柱温为20 ℃，样品盘温度为4 ℃。

2.2.3 衍生条件 衍生化试剂为含有8

SymbolmA@ mol/L氯化血红素和80

SymbolmA@ mol/L对羟基苯乙酸的NH4Cl-NH3•H2O缓冲溶液（pH 10.5）。流速为0.2 mL/min，反应管温度为35 ℃；荧光检测器激发波长315 nm，发射波长400 nm。

2.2.4 样品处理 取1.0 g面粉于10 mL比色管中，加入2 mL乙腈，充分摇匀以沉淀面粉中的蛋白质，再用乙醇定容至10 mL， 充分振荡混匀，用0.45

SymbolmA@ m滤膜过滤后进样。

3 结果与讨论

3.1 衍生反应

本方法基于的柱后衍生反应如下式：

对羟基苯乙酸在Hemin的催化下被过氧化苯甲酰氧化成能够产生荧光的二聚体2,2′-二羟基-联苯-5,5′-二乙酸，而过氧化苯甲酰则被还原成苯甲酸。

3.2 色谱条件的优化

3.2.1 流动相的选择 实验表明，甲醇-水体系作为流动相，过氧化苯甲酰的响应峰峰形拖尾较为严重，加入少量乙酸后， 峰形可以获得明显改善。研究了添加乙酸对BPO响应峰的影响，结果表明，随加入0.1% HAc（V/V）时，BPO响应峰峰形对称，检测速度较快。

考察了不同比例甲醇对过氧化苯甲酰响应峰的影响，结果表明，流动相为甲醇-水（85∶15， V/V）时，过氧化苯甲酰的峰形较好，出峰时间较短，分析速度较快。

3.2.2 柱温的选择 有机过氧化物稳定性一般较差，因此，在分析过程中可能存在分解的现象，因此，在高效液相色谱检测有机过氧化物时往往采用较低的柱温和样品盘温度[12]，但也有采用较高柱温进行分离检测的方法[1]。由于过氧化苯甲酰的半衰期温度为72 ℃/10 h，在20 ℃下，可以忽略过氧化苯甲酰分解造成的影响。因此，柱温选择20 ℃。

3.3 柱后衍生条件的优化

3.3.1 氯化血红素浓度的影响 研究了不同催化剂浓度下对BPO响应峰峰面积的影响，结果见图1a。由该图可知，在其它条件不变的情况下，过氧化苯甲酰的响应峰峰面积在氯化血红素的浓度为8

SymbolmA@ mol/L时达到最大值，表明在此浓度下衍生效率最高。

3.3.2 反应底物的浓度的影响 研究了不同反应底物浓度下对BPO响应峰峰面积的影响，结果见图1b。由该图1b可知，当对羟基苯乙酸的浓度为1

SymbolmA@ mol/L时，无法获得有效的BPO响应峰; 当对羟基苯乙酸浓度达到10

SymbolmA@ mol/L时，随着对羟基苯乙酸浓度的增大，BPO响应峰的峰面积逐渐增大; 当达到80

SymbolmA@ mol/L时，BPO响应峰的峰面积是对羟基苯乙酸浓度为10

SymbolmA@ mol/L时的5～6倍。此后，BPO响应峰的峰面积趋于稳定。因此，对羟基苯乙酸浓度选择为80

SymbolmA@ mol/L。

3.3.3 衍生温度的选择 研究了衍生温度对BPO响应峰峰面积的影响，结果见图1c。由图1c可知，衍生温度为35 ℃时，BPO峰面积最大。因此，选择35 ℃作为最佳衍生温度。

Fig．1 Effect of hemin concentration （a） , p-hydroxyphenylacetic acid concentration （b） and temperature （c） on derivatization efficiency

3.3.4 pH值的影响 对羟基苯乙酸在Hemin的催化下，被过氧化苯甲酰氧化成具有荧光的二聚体2,2′-二羟基-联苯-5,5′-二乙酸，2,2′-二羟基-联苯-5,5′-二乙酸, 在碱性条件下的荧光强度比酸性条件下大得多。分别研究了pH 8～13范围内的衍生条件，结果表明，用NH4Cl-NH3•H2O为缓冲体系，pH为10～11时，衍生效率最佳，灵敏度最好，故选择pH 10.5为优化条件。

3.4 标准曲线、线性范围、相关系数、检出限和重现性

在优化的色谱条件和柱后衍生条件下，选择一系列过氧化苯甲酰标准溶液进行测试，结果表明，在0.5～100 mg/L浓度范围内，BPO响应峰峰面积与其浓度成良好线性关系，线性回归系数R.2＝0.9997，线性方程为A＝

Symbolm@@ 1.05×10.7＋3.34×10.7c， 其中A为峰面积，c为BPO浓度（mg/L）。

本方法对过氧化苯甲酰的检出限为0.1 mg/L（信噪比为3），换算成样品的检出限为1 mg/kg。方法的检出限明显低于目前大多数面粉中过氧化苯甲酰的方法的检出限[1～5,7,8]，说明本方法灵敏度较高。

连续进样6次，计算BPO响应峰峰面积的RSD为2.7%，BPO响应峰保留时间的RSD为0.7%，说明方法的重现性良好。

3.5 样品分析及回收率

随机选择两种市售面粉为分析对象，按照2.2.4节进行样品处理，在优化的色谱条件和衍生条件下进行分析，其标准品的色谱图和样品的色谱图为图2。样品检测和标准加入实验结果见表1。由表1可

知，被分析的市售面粉中含有一定量的BPO，样品的加标回收率在98.5%～99.5%之间，结果令人满意。 图2 过氧化苯甲酰标准色谱图（A）和样品色谱图（B，C）

Fig．2 Chromatograms of benzoyl peroxide （BPO） standards solution （A） and samples（B, C）本方法利用氯化血红素作为催化剂，由于有机过氧化物在Hemin的催化下能够使底物对羟基苯乙酸迅速生成具有较强荧光的二聚体的，实现了面粉中BPO的柱后衍生-高效液相色谱-荧光检测。本方法灵敏度高，线性范围宽，回收率好，具有较好的实用性。

（mg/kg）加标测定结果Found（mg/kg）回收率Recoveries（%）

143.72063.699.5231.62051.398.5

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Determination of Benzoyl Peroxide in Wheat Flour by Post-column

Derivatization-High PerformanceLiquid Chromatography

with Fluorescence Detection

MA Ming1, XIAO Ling-Yan.2, SHENG Ya-Hong.1, HUANG Jiao.1, YU Xiong-Fei.1

.1（Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Technical Center of China, Ningbo 315012， China）

.2（Societe Generale de Surveillance S.A.-China Standard Technology Development Corp.

Standards Technical Services Co., Ltd. Ningbo Branch, Ningbo 315040， China）

Abstract A method for the determination of benzoyl peroxide in wheat flour by post-column derivatization-high performance liquid chromatography with fluorescence detection was developed based on the reaction that the p-hydroxyphenylacetic acid can be oxidized to the fluorescent dimer by benzoyl peroxide with hemin as catalyzer. The optimum derivatization efficiency was obtained with the hemin and p-hydroxyphenylacetic acid concentration at 8

SymbolmA@ mol/L and 80

SymbolmA@ mol/L, respectively, with the derivatization reagent pH at 10.5 and the derivatization temperature at 35 ℃. The linear range between 0.5 mg/L to 100 mg/L was observed for the established method. The sample detection limit was 1 mg/kg and standard spike recoveries were 98.5%－99.5% under the optimized conditions. The obvious advantages of excellent anti-jamming capability and high-sensitivity were observed comparing with other HPLC methods for determination of benzoyl peroxide.

Keywords Post-column derivatization; High performance chromatography; Fluorescence detection; Benzoyl peroxide

（Received 28 July 2011; accepted 30 September 2011）