膜基质免疫分析法同时检测玉米中伏马菌素B1和呕吐毒素

摘 要 建立了基于聚偏氟乙烯膜（Polyvinylidene fluoride, PVDF）基质的直接竞争免疫分析法，同时检测玉米中的伏马菌素B1（Fumonisin B1, FB1）及呕吐毒素（Deoxynivalenol, DON）。PVDF膜用甲醇浸湿、激活，用移液器将 FB1及 DON 全抗原点阵于相应的膜反应区，同时采用三聚氰氯法和高碘酸钠法分别制备抗FB1、抗 DON 的辣根过氧化酶（Horseradish peroxidase, HRP）标抗体（monoclonal antibody, McAb），以直接竞争免疫检测方法的模式实现同时检测玉米中的 FB1及 DON。该方法对于 FB1和DON 的检出限分别为 2.5和50

SymbolmA@ g/L，样品前处理简单，检测时间 15 min，可肉眼辨别结果，随机检测了 30 份市售玉米样品，并与市售 ELISA 试剂盒进行方法学比较，结果无明显差异。

关键词 聚偏氟乙烯膜； 伏马菌素B1； 呕吐毒素； 直接竞争免疫检测

2011-06-24收稿；2011-09-22接受

本文系国家“863”计划项目（No.省略

1 引 言

伏马菌素（Fumonisins, FBs）是主要由串珠镰刀菌（Fusarium moniliforme）产生的水溶性代谢产物[1]，大多存在于玉米及玉米制品中[2]。FB1是其中的主要组分，占伏马菌素总量的 70%～80%[3]，也是导致伏马菌素毒性作用最主要原因。伏马菌素具有神经毒性[4]、免疫系统毒性[5]和致癌性[6]等。瑞典已确定玉米中 FB1和 FB2的最大可接受限量为1 mg/kg[7]，我国尚未制定食品与饲料中伏马菌素的限量标准。

呕吐毒素是主要由禾谷镰刀菌（F.graminearum）和黄色镰刀菌（F.culmorum）产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物，是一种单端孢霉烯族化合物，常污染玉米、小麦和大麦等谷物及其制品[8]，具有免疫毒性[9]、胚胎毒性[10]和细胞毒性[11]。我国规定谷物及其制品中 DON 的限量为1 mg/kg[12]。

真菌毒素的快速检测方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）[13,14]、基于 NC 膜的胶体金免疫层析法（Colloidal gold immunochromatography assay, GICA）[15，16]等。PVDF 膜具有较强的疏水性和静电吸附作用，它对蛋白质具有极强的吸附能力，机械性比硝酸纤维素膜好，室温下不受酸、碱等强氧化剂和卤素等腐蚀，紫外灯照射1年，其性能基本不变[17]，故选用 PVDF 膜作为载体。本研究建立了基于 PVDF 膜基质的直接竞争免疫分析方法，可同时检测玉米中的 FB1 和 DON。样品前处理简单，检测时间 15 min，具有稳定性好、结果准确易于判定、经济实用等优点，适合于大批量样品的现场快速检测。2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Mill-Q超纯水仪、PVDF膜（3.75 m×26.5 cm, 0.45

SymbolmA@ m）、超滤管（10 kDa, 美国Millipore公司）；SORVALL Blofuge stratos台式高速冷冻离心机（德国Heraeus 公司）；WD-9405 B水平摇床（北京沃德生物医学仪器公司）；单管可调微量移液器（0.5～10

SymbolmA@ L, 德国Eppendorf公司）； DON-cBSA 全抗原、FB1-OVA 全抗原（本实验室自制）；抗 DON 单克隆抗体、抗FB1单克隆抗体（本实验室自制）；羊抗鼠IgG-HRP酶标二抗、OTA、AFB1、DON、FB1、FB2、玉米赤霉烯酮（Zearalenone, ZEN）、T-2毒素（T-2）、HT-2毒素（HT-2）标准品（美国Sigma公司）；辣根过氧化物酶（上海生工）；脱脂牛奶（加拿大Bio Basic Inc.公司）；单组分 TMB 显色液（沉淀型，湖州英创生物科技有限公司）；其它试剂均为分析纯以上。

2.2 抗体的纯化和酶标抗体的制备

采用辛酸-硫酸铵法[19]纯化抗 FB1 及抗 DON 单克隆抗体腹水，并用紫外及 SDS-PAGE 电泳测定纯化后抗体的浓度和纯度。

采用三聚氰氯法和高碘酸钠法分别制备抗 FB1和抗 DON 酶标抗体[19，20]。超滤浓缩除盐后，紫外分光光度计扫描，直接竞争 ELISA 方法确定酶标抗体的效价及特异性。

2.3 PVDF 膜基质免疫检测装置的制备

2.3.1 PVDF膜处理 用铅笔在PVDF膜上画出 5 个矩形（20 mm×9 mm），作为膜反应区，每个反应区平均分成 2份，分别作为 FB1和 DON检测区。将 PVDF 膜在甲醇中浸泡 15 s，再于超纯水中浸泡 2 min。

2.3.2 真菌毒素全抗原的点阵及封闭 参照文献[22]，用移液器分别将 3

SymbolmA@ L FB1、DON 全抗原稀释液点阵于膜反应区中，静置10 s后放入湿盒中37 ℃孵育 2 h。5% 脱脂牛奶封闭 1 h，用 PBS 漂洗，晾干。

2.3.3 PVDF 膜组装 将围栏贴在晾干的膜的上方，膜的下方贴上透明宽胶带，使整个膜处于密闭状态。整个 PVDF 膜基质免疫检测装置的制备流程如图1所示。

2.4 同时检测两种毒素膜基质免疫分析法的建立

2.4.1 抗原包被浓度和酶标抗体工作浓度的确定 采用棋盘滴定法[22]确定抗原的包被浓度和酶标抗体的工作浓度。FB1-OVA、DON-cBSA全抗原用PBS稀释为 10， 20， 50， 75和100 mg/L进行包被，酶标抗体用PBS逐级稀释至1000， 2000， 4000， 6000， 8000， 10000， 12000 倍。用RGB-Editor和Matlab软件计算其灰度值。

根据其灰度值，确定抗原包被浓度和酶标抗体工作浓度。

2.4.2 检测方法 用PBS稀释FB1-OVA， DON-cBSA全抗原，浓度根据 2.4.1节的结果确定，按 2.3节进行组装。向膜反应区中加入 200

SymbolmA@ L FB1， DON 混合标准品或者样品稀释液，同时加入 200

SymbolmA@ L酶标抗体，酶标抗体浓度根据2.4.1节的结果确定；在室温摇床上振荡 10 min；倾去液体，PBS洗涤 3 次，拍干，滴加沉淀性TMB显色液，显色 1 min，用超纯水终止。

样品中FB1/DON 的含量低于检出限，则检测区显现蓝色斑点，定义为阳性；相反，定义为阴性（图2）。

Fig．1 Flowchart of preparation of a polyvinylidene fluoride （PVDF） membrane-based immunoassay tester

DON: Deoxynivalenol; FB1: Fumonisin B1; OVA: Ovalbumin.

图2 同时检测 FB1和 DON 膜基质免疫分析结果示意图

Fig．2 Sketch map of membrane-based immunoassay for simultaneous detection of FB1 and DON

1. FB1和DON均为阴性；2. DON为阳性，FB1为阴性；3. FB1为阳性，DON为阴性；4. FB1和DON均为阳性。

1. Both FB1 and DON negative; 2. DON positive, FB1 negative; 3. FB1 positive, DON negative; 4. Both FB1 and DON positive.

2.5 样品提取

称取 1 g粉碎玉米样品于 10 mL离心管，准确加入 5 mL超纯水，置水平摇床，充分振荡15 min，以4000 g离心 10 min，取上清液，用超纯水稀释 4 倍，过 0.45

SymbolmA@ m水系微膜，此时溶液为样品稀释液。

3 结果与讨论

3.1 FB1， DON抗体的浓度和纯度的分析结果

微量紫外可见分光光度计测定纯化好的抗 FB1及抗 DON 单克隆抗体的浓度，结果分别为5.52和6.99 g/L。经SDS-PAGE电泳，纯化后抗体仅出现两条带，一条为IgG重链，约为 50 kDa;另一条为轻链，约为 25 kDa，表明辛酸-硫酸铵法有效除去了腹水中的杂蛋白，纯化比较理想。

3.2 酶标抗体

用紫外分光光度计分别扫描纯化的抗FB1单克隆抗体、抗DON 单克隆抗体、HRP和酶标抗体，其紫外吸收光谱见图3和图 4。与纯化后的单克隆抗体的紫外吸收光谱相比，两种方法合成的酶标记抗体在HRP 的特征吸收峰 403 nm处都出现了明显的波峰；与HRP的紫外吸收光谱相比，两种方法合成的酶标记抗体在260和 280 nm处的吸收峰都明显地增高，初步判断 HRP 与抗体已经成功连接在一起。

经直接竞争 ELISA 测定，FB1酶标抗体的效价为 1024000，IC50＝2.5

SymbolmA@ g/L；DON 酶标抗体的效价为 704000，IC50＝70.3

SymbolmA@ g/L。FB1酶标抗体能识别 FB1与 FB2，而与 AFB1，OTA，DON，ZEN，T-2和HT-2均未见交叉反应，与 FB1和FB2的交叉反应率分别为100%和16 %；DON酶标抗体与AFB1，OTA，ZEN，FB1，FB2，T-2和HT-2均未见交叉反应。

3.3 PVDF膜的制备

由于PVDF膜本身是疏水的，使用前需用无水甲醇预处理，活化 PVDF 膜上带有正电基团，使它更容易与带负电的蛋白质结合。同时将膜放在湿润的滤纸上，通过毛细管作用，使抗原稀释液可以快速被膜吸收。为了保证抗原稀释液在膜上形成均匀的斑点，采用玻璃管在膜上轻轻滚压，除去膜与滤纸之间的气泡。包被必须在相对湿度较高的环境下进行，若包被过程在完全干燥的环境下，会产生较高的本底。

图3 FB1抗体、FB1酶标抗体和HRP的紫外吸收光谱

Fig．3 Ultraviolet absorption spectra of anti-FB1 monoclonal antibody（McAb）， anti-FB1 McAb-HRP and HRP

Fig．4 Ultraviolet absorption spectra of anti-DON McAb, anti-DON McAb-HRP and HRP

3.4 检出限

由棋盘滴定法确定的FB1-OVA和DON-cBSA 全抗原的包被浓度均为 20 mg/L。FB1和DON 酶标抗体的工作浓度分别为 1∶6000和1∶1000。通过重复检测标准品实验发现，加入一系列标准品后，不显色的FB1和DON 的最低浓度分别是 2.5和50

SymbolmA@ g/L。

3.5 稳定性

将制备好的 PVDF 膜真空密闭保存在 4 ℃冰箱内，每隔15 d取出膜，分别检测系列混合标准品。通过检测结果判断膜的保质期。

将酶标抗体用二抗储液稀释至工作浓度，在 4 ℃冰箱内保存，每隔 7 d在包有FB1-OVA/DON-cBSA全抗原的酶标板上检测。

实验表明，本方法重复性良好，PVDF 膜可在 4 ℃真空密封保存 180 d，两种酶标抗体用二抗储液稀释至工作浓度，均可在 4 ℃保存 280 d，满足长期保存的需要。

3.6 加标实验和玉米样品分析

称取 1 g 粉碎的玉米样品，经HPLC验证未被 FB1和 DON 污染，分别添加 25，50，和75

SymbolmA@ g/kg FB1， 500，1000 和1500

SymbolmA@ g/kg的DON混合标准品。按2.6节提取样品。取 200

SymbolmA@ L 样品稀释液于膜反应区，用膜基质免疫分析法检测，检测结果与市售 ELISA 试剂盒方法的检测结果进行对比，结果见表1。由表1可见，当添加 FB1和DON 浓度分别高于 50和1000

SymbolmA@ g/kg时，膜上的蓝色斑点消失，此时呈阳性。市售ELISA 试剂盒检测结果与膜基质免疫分析结果一致，本方法提取玉米样本未对检测方法造成影响。

分别采用膜基质免疫分析法和市售 ELISA 试剂盒测定了在市场上随机购买的 30 份玉米样品，结果见表 2。 FB1和 DON 的检出限分别为 2.5和 50

SymbolmA@ g/L。在膜基质免疫分析法中，将样品稀释20倍，故当玉米样品中 FB1和 DON 浓度分别超过 50 和 1000

SymbolmA@ g/kg 时，呈阳性，不显色。由表2可知，膜免疫分析法测定的结果与市售 ELISA 试剂盒的检测结果基本一致。

表1 玉米样品不同添加水平的膜基质免疫分析法及ELISA试剂盒检测结果比较

Table 1 Comparison of the detection results of corn sample by membrane-based immunoassay and ELISA kit

添加水平

Spike level（

SymbolmA@ g/kg）FB1DON膜基质免疫分析法

Membrane-based

immunoassayFB1DON市售 ELISA 试剂盒ELISA kit

SymbolmA@ g/kg） FB1DON

25500－－23.6434

501000＋＋45.1 912751500＋＋70.41491

注：“－” 表示显色，阴性结果； “＋” 表示未显色，阳性结果 （“－” Showing color , negative result; “＋” No color, positive result）。

分析结果表明，本方法只需一步加样，15 min 内即可完成玉米中的伏马菌素B1及呕吐毒素检测。方法具有稳定性好、结果准确、易于判定、经济实用等优点，适合于大批量样品的现场快速检测。

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Simultaneous Detection of Fumonisin B1 and Deoxynivalenol in Corn

Samples Using a Polyvinylidene Fluoride Membrane-based Immunoassay

KANG Min, XU Yang., HE Qing-Hua, WANG Dan

（Sino-Germany Joint Research Institute, the State Key Laboratory of Food Science and Technology,

Nanchang University, Nanchang 330047， China）

Abstract A Polyvinylidene fluoride （PVDF） membrane-based direct competition immunoassay for simultaneous detection of fumonisin B1 （FB1）and deoxynivalenol （DON） in corn samples was developed. PVDF membrane was soaked and activated in methanol, and then the conjugates （FB1-ovalbumin（OVA） and DON-cBSA） were spotted on the membrane reaction zone using the tip of dispenser. Horseradish peroxidase （HRP） was successfully coupled to anti-FB1 monoclonal antibody （McAb） and anti-DON McAb by cyanuric chloride method and periodate method respectively. Simultaneous detection of fumonisin B1 and deoxynivalenol in one membrane in the system was carried out under direct competition immunoassay mode. The detection limits for fumonisins B1 and deoxynivalenol were 2.5 and 50

SymbolmA@ g/L, respectively. With very simple sample pre-treatment, a batch of extracted samples was analyzed within 15 min. The concentration and type of mycotoxins in samples were determined visibly by the naked eye. Fumonisins B1 and deoxynivalenol in 30 corn samples were screened by the PVDF membrane-based immunoassay, the results showed no significant difference with the ELISA kit．

Keywords Polyvinylidene fluoride membrane; Fumonisins B1; Deoxynivalenol; Direct competition immunoassay

（Received 24 June 2011; accepted 22 September 2011）