酸、碱性氧化电位水替代硫酸洗液的实验研究

[摘要] 目的：探讨酸性氧化电位水(EOW)和碱性氧化电位水(AOW)替代硫酸-重铬酸钾液清洗玻璃器皿，用于细胞培养、生物材料、生化检测等实验的可行性。方法：取玻璃培养瓶、试管和吸管各100个（只），洗涤灵洗刷、自来水冲净，烤干后分3组浸入各浸泡液中。A组：硫酸-重铬酸钾洗液；B组：EOW；C组：AOW。浸泡24 h后取出，自来水冲洗10遍，双蒸水2遍、三蒸水1遍，烤干，高压蒸汽灭菌后接种RSC-364大鼠滑膜细胞，分别进行细胞生长速度、贴壁率、存活率和活细胞形态比较。结果：细胞生长速度测定：1～3 d为对数长生期，平均倍增时间A组为26 h，B组34.7 h，C组25.8 h；4～5 d为平台期，细胞生长减慢；第6天细胞停止生长，增殖曲线迅速下降。细胞贴壁率：A组74%，B组65%，C组70%（P>0.05）。细胞存活率：A组93.5%，B组94.1%，C组94.6%（P>0.05）。三组细胞形态变化不大，接种后第1天，95%的细胞由圆形逐渐贴壁成长梭形；第5天细胞长满瓶壁，生长减慢。结论：A、B、C三组细胞生长速度接近，酸、碱性氧化电位水均可替代硫酸洗液清洗玻璃器皿，用于细胞培养。

[关键词] 硫酸洗液；酸性氧化电位水；碱性氧化电位水

[中图分类号]Q813.1[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2007）08（a）-035-02

The experimental study of electrolyzed oxidizing water and alkalized oxidizing water in replacing sulfuric acid solution

ZUO Xiang-hua, CHEN Jian-kui, JIN Xin, HUANG Yuan, LI Yu-rong, ZHENG Na-xin,ZHU Xiao-hua

(Department of Medical Laboratory, Affiliated Hospital, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071，China)

[Abstract] Objective: To study the effect of electrolyzed oxidizing water and alkalized oxidizing water replacing sulfuric acid solution on the cleaning of cell culture glassware. Methods: The glass culture bottles, test tubes and suction tubes were randomly divided into three groups. Group A immersed in sulfuric acid, group B in electrolyzed oxidizing water (EOW), group C in alkalized oxidizing water (AOW). 24 hours later, they were dealt with asusural, and then cultivated RSC-364 cells. The cell growth rate, attachment efficiency, survival rate and cell shape were compared respectively. Results: Cell doubling time was 26 hours in group A, 34.7 hours in group B, 25.8 hours in group C. Attachment efficiency of group A was 74%, group B was 65% and group C was 70%. Cell survival rate of group A was 93.5%, group B was 94.1% and group C was 94.6%. The changes of cell shape were not obvious. Conclusion: The cell growth rates of three groups are similar. The application of electrolyzed oxidizing water and alkalized oxidizing water has substantial value for replacing sulfuric acid solution on the cleaning of cell culture glassware.

[Key words] Sulfuric acid solution; Electrolyzed oxidizing water; Alkalized oxidizing water

自1923年Carrel[1]设计了卡氏瓶后，即开始使用硫酸浸泡处理与组织细胞培养有关的玻璃器皿，去污效果良好。但由于硫酸腐蚀性极强，对人体和环境均有毒、有害，存在较大的危险性。有些实验室采用一次性塑料培养瓶、多孔板等替代玻璃器皿，但成本较高。酸性氧化电位水（Electrolyzed Oxidizing Water，EOW)和碱性氧化电位水（Alkalized Oxidizing Water，AOW)是一种对人体无毒、环保无害、使用方便的溶液，本研究探讨了EOW和AOW替代硫酸-重铬酸钾液用于玻璃器皿清洗的可行性，现报道如下：

1 材料和方法

1.1 仪器

酸化水机（北京洲际资源环保科技公司）；二氧化碳孵箱（德国Heraeus bb506型）；Olympus1X-17倒置显微镜；国产细胞培养玻璃瓶。

1.2 试剂

工业硫酸、重铬酸钾(北京化工厂生产)，酸性氧化电位水(EOW)，碱性氧化电位水（AOW），DMEM培养液，胰蛋白酶(美国sigma公司), 胎牛血清(北京圣玛亨利公司)。

1.3 细胞株

RSC-364大鼠关节滑膜细胞系。

1.4 实验方法

1.4.1 分组将浸泡液分A、B、C组。A组：硫酸-重铬酸钾浸泡液；B组：EOW浸泡液；C组：AOW浸泡液。用每组浸泡液清洗20个培养瓶、试管、吸管，各组同时浸泡24 h，取出后均用自来水冲洗10遍，用蒸馏水冲洗3遍，用三蒸水冲洗1遍，烤干后，包布包好后高压蒸汽消毒备用。

1.4.2 细胞培养经三种洗液处理后的培养瓶用RSC-364大鼠滑膜细胞做细胞生长速度比较[2]。每组接种18瓶，每瓶加DMEM培养液（10%FBS，pH7.2）3 ml，接种RSC-364大鼠滑膜细胞数6×104，置37℃、5%的CO2孵箱培养6 d，每天每组各取3瓶用0.25%胰蛋白消化成单细胞悬液后计数，求每组的平均细胞数。按倍增时间＝0.301T/(LogN2-LogN1)计算出每组细胞生长的倍增时间[3]，同时在倒置显微镜下将在瓶中生(上接第35页)

长的细胞照相，比较活细胞的形态变化。细胞贴壁率和存活率计算：每瓶按细胞1×105培养3 h后吸出未贴壁细胞记数，计算出贴壁细胞和总细胞数之比（贴壁率），同时用1%台盼兰染色，计算每组细胞存活率。

1.5 统计学方法

MicrocalOriginpro 7.0 统计学软件包，采用相应设计定量资料的t检验进行分析。

2 结果

各试验组细胞在前3 d为对数生长期，平均倍增时间：A组26 h，B组34.7 h，C组25.8 h，各组倍增时间呈直线上升，4~5 d细胞生长速度减慢，第6天细胞增殖曲线下降（图1）。各试验组细胞生长速度很接近，贴壁细胞形态呈长梭形，有分裂相，与接种前组间细胞形态无明显区别。细胞在接种3 h后的贴壁率和存活率见表1。B 组和C 组与A组相比无显著性差异（P>0.05）。

3 讨论

硫酸洗液浸泡玻璃器皿在细胞培养技术中的应用历史长、效果好，许多学者将它写入了实验手册[1,4]。因为硫酸洗液配制时的危险性极大，对人体和环境有害，配制时需要三人以上共同配合，全副武装：眼镜、耐酸手套、口罩、帽子、围裙等，稍不小心就可能被灼伤皮肤和眼睛；而且价格稍贵，10 L约320元；配一次可用3个月至半年，废液倒入下水道对水管和地下水源易造成污染和破坏。EOW和AOW浸泡液使用方便，开机即可放出，它既能灭菌，又可去污[5]，对人体无毒无刺激性，可用手直接接触，对环境无害。EOW水和AOW水加自来水中和，pH值升到6，就还原成自来水，倒入下水道对环境无害。EOW和AOW二者可单独使用，也可合用，先用pH 12以上的AOW水浸泡后，可去污，再用pH2.7以下的EOW浸泡，既能去污又灭菌，更优于硫酸洗液。但也有缺点，虽然使用原料食盐加自来水价格便宜，1L EOW、AOW只需4分钱，但购买生产两种水的机器较贵，限制了其使用范围。但AOW有灭菌、防止创面感染、处理生物材料等多种功效[6]，可节约经费，替代硫酸浸泡液，是一种符合环保要求、对人体无害、有效、节约型的选择。

[参考文献]

[1]鄂征. 组织培养技术[M]. 第2版. 北京：人民卫生出版社，1986. 4，91-93.

[2]薛庆善. 体外培养的原理与技术[M]. 北京：科学出版社，2001. 76，340-342.

[3]王丛妙，蔡醒华，黄靖香，等. 一种简单方便的滑膜细胞培养法[J]. 军医进修学院学报，1996，17：87.

[4]Jakoby, William B, Ira H, et al. Methods in Enzymology [M]. Volume LVⅢ Cell Culture. Academic press Inc, 1979. 141.

[5]李盛，徐庆华，谢慧娟，等. 高氧化还原电位水杀灭微生物效果的试验观察[J]. 中国消毒学杂志，2000，17(1)：9-11.

[6]李娇娥，易滨，傅春华，等. 强氧化离子水含嗽治疗口腔溃疡的观察[J]. 中华护理杂志，2000，35(3)：162-163.

（收稿日期：2007-16-03）

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