反相高效液相色谱法对畜产品中三聚氰胺残留的检测

摘要：建立了畜产品包括生鲜乳、禽蛋、禽肉中三聚氰胺残留检测的反相高效液相色谱方法。样品经1%的三氯乙酸提取，饱和乙酸铅沉淀蛋白。经固相萃取柱MCX净化，于高效液相色谱仪紫外法测定，外标法定量。三聚氰胺在0.2～20.0μg/mL 范围内线性良好，相关系数为0.999 8 。在 0.2～1.0 mg/kg浓度范围内，平均加标回收率在 70%以上，批内变异系数在10%以内，批间变异系数在15%以内。方法的检出限为0.05 mg/kg ，定量限为0.10mg/kg 。该方法定量限低，回收率高，可以同时测定多种样品，方便省时，满足农产品检验工作的需要。

关键词：三聚氰胺；畜产品；高效液相色谱法（HPLC）；MCX固相萃取柱

中图分类号：TS252.7 文献标识码：A 文章编号：1007-273X（2013）06-0011-04

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 试剂与材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为millipore超纯水。甲醇（色谱纯）；氨水（含量为25%～28%）；三氯乙酸；柠檬酸；庚烷磺酸钠（色谱纯 ）；乙酸铅；Waters MCX固相萃取柱（60 mg，3 mL）； 滤膜（0.45 μm，有机相）；氮气（纯度大于等于99.999% ）；三聚氰胺标准品（纯度>99%）。

1.1.2 仪器与设备 高效液相色谱仪（waters2695）配有紫外检测器；离心机；超声提取器；旋涡混合器；震荡摇床；固相萃取装置；氮吹仪；分析天平（感量为0.000 01 g和0.01 g）。

1.2 方法

1.2.1 标准储备液配制及标准曲线的绘制 准确称取100.0 mg（精确到0.1 mg）三聚氰胺标准品于100 mL 容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL 的标准储备液，于4 ℃避光保存。有效期3个月。

准确移取20.00 mL标准储备液，于100 mL 容量瓶中，用50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成浓度为0.2 mg/mL 的稀释液。用流动相逐级稀释得到浓度为0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg/mL的标准工作液，浓度由低到高进样检测以峰面积-浓度作图得到标准曲线回归方程。

1.2.2 三聚氰胺样品前处理 ①称取样品5.00 g（精确至0.01 g）试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入20 mL 1%三氯乙酸溶液和1 mL饱和乙酸铅，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于10 000 r/min离心5 min，上清液待净化。②依次用3 mL 甲醇、3 mL 水活化MCX固相萃取柱 ，将待净化液转移至固相萃取柱中，依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后。③用5 mL5%氨化甲醇溶液洗脱，用试管收集洗脱液。整个固相萃取过程流速不超过1 mL/min。④洗脱液于50 ℃下用氮气吹干。⑤残留物用1 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过0.45 μm微孔滤膜后，供HPLC测定。

1.2.3 定量限和检测限的测定 最低检测限和最低定量限的确定，是根据信噪比（S/N）的值来确定的。称取6份空白组织，按照“1.2.2”步骤处理后，测得基线噪音值，求其平均值。

按照信信噪比S/N=3时相对的添加浓度为检测限，S/N=10时相对的添加浓度为定量限。

1.2.4 添加回收率和精密度测定 称取试样（5±0.05） g于50 mL离心管中，加入适量标准贮备液，使其各农产品添加浓度分别为0.1、0.2、1.0 μg/kg，每个添加浓度设5个平行，按照1.2.2项下步骤操作进行测定，根据峰面积计算添加回收率和批间、批内变异系数。

1.2.3 高效液相色谱测定 HPLC参考条件： ①色谱柱 C18柱，250 mm×4.6 mm，粒度5 μm，或相当者。②流动相：离子对试剂缓冲液（准确称取2.10 g 柠檬酸和2.02 g 庚烷磺酸钠于1 L容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度）-乙腈（90+10，V/V），混匀。③流速：1.0 mL/min。④柱温：40℃。⑤波长：240 nm。⑥进样量：20 μL。

2 结果与分析

2.1 线性关系

在浓度为0.2～20.0 μg /mL的范围内，三聚氰胺的峰面积与其浓度呈线性相关，见表1。

2.2 检测限和定量限

根据6个空白组织的基线噪音平均值，按信噪比S/N=3为检测限，S/N=10为定量限，求得在生鲜乳、禽蛋、禽肉中检测限为0.05 mg/kg，定量限为0.10 mg/kg。

2.3 添加回收率和精密度

在生鲜乳、禽蛋、禽肉中添加浓度为0.1、0.2、1.0 μg/kg的三聚氰胺，进行添加回收试验，各产品的平均回收率在70%以上，批内变异系数在10%以内，批间变异系数在15%以内。结果见表2～表6。

3 结论

建立了农产品包括生鲜乳、禽蛋、禽肉中三聚氰胺残留检测的反相高效液相色谱方法。样品经1%的三氯乙酸提取，饱和乙酸铅沉淀蛋白。经固相萃取柱MCX净化，于高效液相色谱仪紫外法测定，外标法定量。三聚氰胺在0.2～20.0 μg/mL 范围内线性良好，相关系数为0.999 8 。在 0.1～1.0 mg/kg浓度范围内，平均加标回收率在70%以上，批内变异系数在10%以内，批间变异系数在15%以内。方法的检出限为0.05 mg/kg ，定量限为0.10 mg/kg。该方法定量限低，回收率高，可以同时测定多种样品，方便省时，满足农产品检验工作的需要。