离子对反相液相色谱法分析硫代寡核苷酸药物流感泰得的有关物质

摘 要 建立了离子对反相液相色谱（IPRPLC）分析流感泰得（Flutide）有关物质的方法，并将其与其它两种常用方法（离子交换色谱（IEC）和毛细管凝胶电泳（CGE）法）的分析结果进行比较。合成了Flutide及其单核苷酸缩短序列5′n－1、3′n－1和单氧代序列5′（P＝O）1，将它们作为已知杂质，在IPRPLC上进行分离条件的优化，使用的分析柱为XTerra MS C18柱（250 mm×4.6 mm, 3.5

SymbolmA@ m）；流动相A为142 mmol/L HFIP36 mmol/L TEA10%甲醇（V/V），流动相B为甲醇；梯度洗脱；流速为0.5 mL/min；柱温为50℃；检测波长为260 nm。结果表明，在该条件下，Flutide能同时与这几种杂质进行分离，其中与缩短序列5′n－1和3′n－1可实现基线分离，而与5′（P＝O）1之间的分离度也能达到0.94。所建立的IPRPLC方法已成功应用于Flutide粗品和纯品中各类杂质的分析和鉴定。

关键词 离子对反相液相色谱； 硫代反义寡核苷酸； 流感泰得； 质量控制; 杂质

1 引 言

随着生物技术市场的发展，反义寡核苷酸药物得到了广泛的应用，尤其是硫代反义寡核苷酸（PSODN），通过对核酸骨架中非桥键氧原子的硫代修饰，增加了对核酸酶的稳定性，提高了反义活性，并且显示了良好的药代动力学性质，具有广阔的药学应用前景[1～4]。尽管寡核苷酸自动合成是一个高效率过程，但每一步仍会产生少量杂质。据报道[5]，人工合成硫代寡核苷酸的杂质主要包括缺失核苷酸的缩短序列（n－x）和少量硫代不完全序列（P＝O）x。这些杂质常用的分析方法主要为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、毛细管电泳（CE）和离子交换色谱（IEC）等[6]。近年来，离子对反相液相色谱（IPRPLC）通过与质谱的联用，已成为核酸药物质量控制和体内外代谢产物研究的重要分析手段[7,8]。

流感泰得（Flutide）是本实验室筛选获得的一条以流感病毒基因组RNA的5′非编码区（UTR）为靶、全长13个碱基的硫代修饰反义寡核苷酸药物，体内外药效学评价研究证明其具有较好的抗病毒活性[9]。为了对该反义核酸药物进行质量控制，本研究建立了一种改进的IPRPLC方法，采用HFIP/TEA作为离子对试剂，并对离子对试剂浓度和洗脱梯度等条件进行了系统优化，获得了同时分离Flutide全长序列（n）与缩短序列杂质5′n－1, 3′n－1，以及单氧代序列杂质5′（P＝O）1的分析条件，并采用电喷雾质谱（ESIMS）进行了结构确认。同IEC和CGE比较，该方法提供了更好的分离选择性，且操作更为便捷。该方法已成功应用于Flutide粗品和纯品的杂质分析。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

三乙胺（TEA，纯度99.5%）、1,1,1,6,6,6六氟异丙醇（HFIP，纯度＞99%）、甲醇（MeOH，纯度99.9%）和乙腈（ACN，纯度99.9%）均购自SigmaAldrich公司；MilliQ纯水（18 MΩ cm－1）纯化自MilliQ系统（美国Millipore公司）；乙二胺四乙基（EDTA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、NH4Cl等为国产分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）。

Flutide是长度为13个碱基的硫代修饰寡核苷酸（序列为5′CCTTGTTTCTACT3′），采用KTApilo Ⅱ核酸合成仪（美国GE Healthcare公司）进行合成，制备液相色谱纯化，超滤脱盐，旋转蒸发浓缩后冷冻干燥得到。缩短序列5′n－1 5′CTTGTTTCTACT3′、缩短序列3′n－1 5′CCTTGTTTCTAC3′和单氧代序列5′（P＝O）1 5′COCTTGTTTCTACT3′（序列中标有O的位置表示氧代）的合成和纯化方法同上。

2.2 实验方法

2.2.1 IPRPLC的色谱条件 2695液相色谱系统，996二极管阵列检测器（美国Waters公司）；分析柱为XTerra MSC18柱（250 mm× 4.6 mm，3.5

SymbolmA@ m，美国Waters公司）。样品浓度为200

SymbolmA@ mol/L, 取10

SymbolmA@ L进样。流动相A为142 mmol/L HFIP36 mmol/L TEA10%甲醇（V/V），流动相B为甲醇；梯度洗脱: 0～35 min, 0%～20% B; 35～37 min, 20%～0% B，平衡8 min；流速0.5 mL/min；柱温50 ℃；检测波长为260 nm。考察结果以分离度（R＝2（tR2－tR1）/（w1+w2））作为标准评价，其中, tR1和tR2分别代表前后两个色谱峰的保留时间，w1和w2为各自的峰宽。

分 析 化 学第39卷

第12期王 颖等： 离子对反相液相色谱法分析硫代寡核苷酸药物流感泰得的有关物质

2.2.2 IEC的色谱条件 600液相色谱系统，2487双波长紫外可见检测器（美国Waters公司）; 分析柱为DNAPac PA100柱（250 mm×4 mm，5

SymbolmA@ m，美国Dionex公司）；流动相A为1 mmol/L EDTA25 mmol/L Tris10%乙腈（V/V），流动相B为1 mmol/L EDTA25 mmol/L Tris3.0 mol/L NH4Cl10%乙腈（V/V）；梯度洗脱：0～30 min，10%～70% B；30～31 min，70%～100% B；31～36 min，100% B；36～41 min，100%～10% B。流动相均用MillQ水配制并用0.45

SymbolmA@ m滤膜过滤；流速为1 mL/min。柱温50 ℃；检测波长为260 nm；分析软件为Millenium32。

2.2.3 CGE的分析条件 P/ACE MDQ毛细管电泳系统（美国Beckman公司）；eCAPTM DNA毛细管、eCAPTM ssDNA 100R胶，Tris硼酸和尿素缓冲液干粉。缓冲溶液为Tris硼酸7 mol/L尿素，pH 8.5；分离胶为250 g/L ssDNA 100R凝胶，分离电压为－15.5 kV；分离温度为40 ℃；采用电动进样，进样电压－10 kV；检测波长为254 nm；分析软件为Beckman P/ACE system MDQ version 2.3。

2.2.4 ESIMS的分析条件 质谱采用TSQ7000电喷雾质谱仪（美国Thermo公司），操作系统为Xcalibur，采用美国Agilent HPLC1100分离，样品经反相C18柱脱盐后，取100

SymbolmA@ L直接进样分析；毛细管电压3.5 kV; 射频透镜电压0.5 V;离子源温度分别为180 ℃；离子源内真空度4.6×0－6 Pa,注射泵的流速为2

SymbolmA@ L/min, 采用负离子扫描模式，扫描范围500～3000 U；数据分析软件为Promass。

3 结果与讨论

3.1 IPRPLC分析条件的建立和优化

3.1.1 流动相优化 作为实际药物使用的单链寡核苷酸多由不同碱基排列组合而成的序列，因碱基组成不同带来的样品特殊性给分析和质量控制增加了难度[10]。IPRPLC法的分离主要基于不同长度寡核苷酸的带电量和疏水性。最常用的离子对试剂为醋酸三乙胺（TEAA），然而TEAA对于长度大于25 mer的序列，分离全长序列（n）和失去一个碱基的缩短序列（n－1）效果较差[11]，并且由于硫代修饰后产生数个手性中心，导致峰展宽严重，因此该试剂主要用于未修饰的寡核苷酸。此外，TEAA和质谱联用时还容易产生离子抑制[12]，不适用于后续的质谱鉴定分析。2001年, Apffer等[13]提出的HFIP能消除非对应异构体的影响，且与质谱兼容性好，离子化效率高，HFIPTEA离子对试剂已成功运用于LCMS联用分析寡核苷酸及其代谢产物[14]。

本实验选用XTerra MS C18柱，考察了不同浓度HFIPTEA离子对试剂条件下Flutide的5′n－1, 3′n－1杂质与n的分离度。研究发现, HFIP浓度在100～142 mmol/L范围内、提高TEA的浓度时，3种化合物之间的分离度均有提高。然而，继续增加HFIP和TEA的比例时，分离度反而下降。当HFIP浓度为142 mmol/L，加入36或43 mmol/L的TEA时，分离度最好，但后者在流动相配制时，TEA很难完全溶解，需搅拌很长时间，同时pH值升高。本实验最终选择142 mmol/L HFIP36 mmol/L TEA作为流动相，具体分析结果见表1和图1。

同时还考察了相应浓度下5′n－1与5′（P＝O）1及n之间的分离度。发现HFIP在低浓度时，随着TEA浓度的升高，三者之间的分离度增加，142 mmol/L HFIP36 mmol/L TEA时达到最大，R5′n－1, n＝1.72，R5′n－1, 5′（P＝O）1＝0.63，R5′（P＝O）1, n＝0.94；继续增加HFIP和TEA的浓度，三者分离度均下降（图2）。由于不

SymbolmA@ m）进行了比较，考察填料种类、分离效率及0.5 mL/min流速下的柱反压。结果表明，XTerra MS C18柱和XBridge OST C18柱具有相似的保留能力，但后者具有更好的稳定性和重现性，并且柱长较短，相同柱效下梯度洗脱时间短，有效缩短了分析时间，但其缺点是价格较高，因此本研究选取XTerra MS C18柱用于Flutide常规的质量控制。

3.2 IPRPLC与IEC，CGE分析方法之间的比较

对基于不同分离原理的3种方法进行了比较，考察了Flutide（n）分别添加缩短序列以及添加硫代不完全序列的分离效果（图3）。研究证明，IEC法能较好分离硫代不完全杂质5′（P＝O）1，但对n－1的分离度较差；CGE法无法分离全长序列n和硫代不完全杂质（P＝O）x，能与n－1进行分离，但无法分离3′n－1和5′n－1； IPRPLC法可将Flutide全长序列n与n－1和5′（P＝O）1两类杂质同时实现分离，且能区分开3′n－1和5′n－1，因此该方法更适合于复杂杂质的分离鉴定。

3.3 IPRPLC方法在Flutide杂质分析中的应用

IPRPLC法能够很好分离Flutide粗品和纯品中各缩短序列杂质，测得粗品纯度为86.84%（图4a），纯品纯度为98.06%（图4b）。其中，主要杂质5′n－1能够与主峰完全分离，5′（P＝O）1与主峰实现部分分离。对Flutide粗品和纯品进行了ESIMS分析（表3），结果表明， Flutide粗品IPRPLC分析图谱中最靠近主峰的两个主要杂质被确认为5′n－1和5′（P＝O）1，其中5′n－1分子量测定结果为3753.9（理论值为3754.1），5′（P＝O）1分子量测定为4043.2（理论值为4043.4）。Flutide纯品IPRPLC图谱中最靠近主峰的主要杂质被确认为5′n－1。

3.4 小结

本研究所建立的IPRPLC法能很好地分离硫代寡核苷酸全长和n－x序列，同时能部分分离出5′（P＝O）1杂质，检测专属性更高，优于IEC和CGE两种方法，因此单独应用IPRPLC即可对这两类杂质进行分析，而通常需要IEC和CGE联合分析才能达到该目的，简化了分析步骤。此外，本方法还能弥补CGE重现性差的缺点，同时避免了IEC采用高盐流动相带来的不便，能够更好地应用于Flutide的质量控制。

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An IonPair Reversed Phase Liquid Chromatographic Method for

Analysis of Related Substances in Phosphorothioate

Antisense Oligonucleotide Flutide

WANG Ying1,2, LU DanDan2, ZHANG YuLin2, GAO Chan2, LI Shu2, WANG ShengQi*2

1（Anhui Medical University, Hefei 230032）

2（Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Science, Beijing 100850）

Abstract An ionpair reversed phase LC method （IPRPLC） was developed for the analysis of related substances of a phosphorothioate antisense oligonucleotide flutide and routine quality control. The analytical result of IPRPLC was compared with ion exchange chromatography （IEC） and capillary gel electrophoresis （CGE）. The synthesized flutide and its analogs of monphosphodiester 5′（P＝O）1 as well as deletion sequences 5′n－1 and 3′n－1 were analyzed. The optimized conditions of IPRPLC were as follows: XTerra MS C18 （250 mm × 4.6 mm, 3.5

SymbolmA@ m） column; the mobile phase A was 142 mmol/L 1,1,1,3,3,3hexafluoroisopropanol （HFIP）36 mmol/L triethylamine acetate （TEA）10% methanol （V/V）, the mobile phase B was methanol; the gradient from 0 to 20% of solution B in 35 min, then back to 0% in 2 min, equilibrated 8 min; column temperature: 50 ℃; flow rate of mobile phase: 0.5 mL/min; detection wavelength: 260 nm. The result showed that under these conditions, flutide, deletion sequences 5′n－1 and 3′n－1 could be completely separated from each other and the resolution R of flutide and 5′（P＝O）1 could reach to 0.94. The proposed IPRPLC method has been applied for the related substances analysis and identification of crude and purified flutide samples, indicating that this method can be used for the quality control of phosphorothioate antisense oligonucleotide.

Keywords Ionpair reversed phase liquid chromatography; Phosphorothioate oligonucleotides; Flutide; Quality control; Related substance analysis

（Received 18 April 2011; accepted 15 June 2011）