破溃兔扩张皮瓣的细菌学研究

[摘要]目的：研究扩张皮瓣破溃后不同时段及部位的细菌状态。方法：以新西兰大白兔作为实验动物。首先形成兔扩张皮瓣模型，进而形成破溃的扩张皮瓣模型，并随机分为A、B、C、D破溃时间长短不同的四组。各组的皮瓣组织均以破口为中心，呈环状由内向外分为6个部分；然后在无菌的环境下分别对这6个部分进行标本采集。采取的标本采用Cooney法进行细菌定量检查和常规接种、需氧和厌氧培养定性检查。结果：①随着破溃时间的延长，破口周围炎症反应的皮肤长度逐渐增大，皮瓣组织内的细菌数量逐渐增多；各组间有显著差异（P＜0.05）；②破溃时间大于3周，皮瓣基底出现感染几率明显增大（17%vs 100%；P＜0.05），此时整个皮瓣组织都有细菌的存在；③皮瓣基底未感染时，细菌仅存在于破口周围炎症反应的皮肤包膜复合组织及其外0.5cm的范围内；④存在的细菌主要为革兰阳性菌。结论：扩张皮瓣破溃后，皮瓣各部的细菌状况会出现改变，临床上应予注意。

[关键词]扩张皮瓣；破溃；细菌学

[中图分类号]R332 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）01-0058-03

The experimental study of the bacteriology of the recipient bed of the ruptured expanded flap

HU Shou-duo1,ZHAO Yan-yong2,JIANG Hai-yue2,YANG Qing-hua2,ZHUANG Hong-xing2

( 1.Plastic and Cosmetic Surgery Department of the Peking Hospital of Integrated Chinese with Western Medicine,Beijing 100039,China; 2. Plastic Surgery Hospital of Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing 100114,China)

Abstract: Objective To study the bacteriology of the ruptured expanded flap. Methods The New Zealand White rabbits were selected as experimental animals. Firstly,the ruptured expanded flap animal models were made and were randomly classified into four groups, named as A group,B group, C group and D group. The tissues of the flap of each group were divided into six parts from center to edge when taking the rupture as the center. The specimens were taken from these parts. All the specimens were quantificationally examined with Cooney's method and qualitatively examined for gram smear and aerobic and anaerobic cultures. Results The experiment results revealed that: ①with the extension of the rupture time, the length of the inflammatory reaction skin-capsule composite tissue gradually increased,the bacterial number in the flap tissue increased. the significant differences existed between each group(P0.05). ② If the rupture time lasted more than three weeks, the infectious ratio of the floor would increase significantly (17%vs67%;P0.05). when the floor infection did exist, bacteria could be found in all parts of the flap. ③If the floor didn't infect,the bacteria exist within the scope 0.5cm longer than the inflammatory reaction skin-capsule composite tissues. ④ the main kind of bacteria was gram-positive bacteria. Conclusions The bacteriology of the flap was changed when the expanded flap was ruptured, more attention should be given in clinic.

Key words:expanded flap; rupture; bacteriology

利用组织扩张术的外耳再造术是一种非常经典的手术方法[1-2]，耳廓支架对受区的血供及无菌环境要求非常高，若受植床出现细菌滋生，导致感染情况的出现，则会致使手术的彻底失败。受植床感染除了局部有感染源存在、血源性感染、不明原因感染外，扩张皮瓣溃破亦是导致感染出现的一个诱发因素。但是否所有破溃都会导致感染出现？皮瓣破溃后经历怎样的细菌状态改变？目前尚无相关研究，为此，我们设计本试验，以期为临床解决此问题提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物：4～8个月新西兰大白兔24只,体重1.8～2.4 kg，由北京农业大学动物研究中心提供，中国协和医科大学中国医学科学院整形外科医院实验动物研究中心检测并饲养。

1.2 模型的制备及分组：按常规无菌手术操作规则，将50ml的扩张器植入兔的头部，常规注水，形成扩张皮瓣动物模型（如图1），然后以扩张皮瓣颞浅血管可见分支的远端作为恒定破口位置，形成直径均为1.0cm的溃破扩张皮瓣模型（如图2），取下的组织作为对照行细菌学检查。

对上述模型随机分组为A、B、C、D四组，每组6只。A组为破溃后观察一周组；B组为观察两周组；C组为观察三周组；D组为观察四周组。

1.3标记取材部位：如图3，本实验将破溃扩张皮瓣按距破口的位置由近及远分为6个部分：环破口肉眼可见异常部（亦称炎症反应部）、环1、环2、环3皮瓣组织部（环间距为0.5cm）、其余皮瓣组织部及基底包膜组织部。然后分别对这6个部分取材，进行细菌学检查。若破口周围炎症反应皮肤范围过大，不能按上述方法分部，则可依次省去相应部分。

1.4 标本采集：采用直接标本采取(如图4)和试子擦拭标本采取两种方法

1.5 标本的处理

1.5.1 试子采取的标本的处理：分别进行涂片、接种于需氧培养基（普通血平皿、中国兰平皿）、厌氧血平皿和液体培养基中。

1.5.2 直接采取标本的处理：对各部分采取的标本，分别在无菌的条件下称重。各组分别用不同的无菌手术剪刀把切下组织剪成碎片，放入无菌研磨器中，每克加入1ml无菌营养肉汤，研磨成组织匀浆。然后进行定性或定量[3]细菌学检查。

1.6 细菌学检查：所有细菌学研究方面的操作，均由资深细菌学专家现场指导。细菌的分离、培养、鉴定均按《全国临床检验操作规程》和API鉴定条说明将细菌鉴定到种。质控菌株：大肠埃希菌(A TCC25922)、铜绿假单胞菌(A TCC27853)和金黄色葡萄球菌(A TCC25923) 。

1.7 统计分析：应用正版统计软件SPSS 12.0 进行统计分析，数据汇总与绘图则用Excel 2003。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）、精确概率法（Fisher's Exact Test）、t检验，χ2检验，检验水准α＝0.05。

2 实验结果

2.1 破溃扩张皮瓣模型形成时取下组织的细菌学结果：需氧菌和厌氧菌培养细菌学检测均为阴性。

2.2 细菌定量检查结果:A组细菌数量多为103CFU/g水平；B组多为103～104 CFU/g；C组多为105 CFU/g；D组以106 CFU/g水平以上为主。其结果如图5所示：

2.3 细菌定性检查结果：共检出56个菌株，需氧菌42株，其中G＋菌株33株，占58.9%，G－菌株19株，占33.9%；厌氧菌4株，占7.2%。G＋菌株中，金黄色葡萄球菌占45.5%； 表皮葡萄球菌占24.2%；粪肠球菌占12.1%，溶血性葡萄球菌和枯草芽胞杆菌分别占6.1%；乙型溶血性链球菌和假白喉棒状杆菌分别占3.0%。G－菌株中，铜绿假单孢菌42.1%，肺炎克雷伯菌占31.6%，大肠埃希菌15.7%，普通变形杆菌和阴沟肠杆菌各占5.3%。厌氧菌为厌氧消化链球菌和嗜酸乳杆菌，均见于4例出现感染的模型中，未出现感染的模型中未检测的厌氧菌。

2.4 定位检查：包膜基底未感染时：①破口周围炎症反应皮瓣组织内均有细菌存在,且数量最多；②环1组织细菌检测阳性率为57%,环2、环3和其他皮瓣组织细菌检测阳性率均为0，于环1差别显著（P0.05）；③ 基底包膜复合组织细菌检查阴性。包膜基底感染时：皮瓣各部分均有细菌存在，基底部位数量最多。

2.5 药敏结果：G＋菌株中，去甲万古霉素、提考拉宁敏感；G－菌株中，对亚胺培南、哌拉西林/他唑巴坦、妥布霉素敏感；厌氧菌对甲硝唑敏感。

2.6 在两种取材方法阳性率的比较中，切取组织细菌培养方法出现的阳性率为100%，是比较可靠的方法，而试子擦拭法阳性率低，为20%，不太可靠。

3 讨论

3.1组织扩张术在外耳再造中的应用：组织扩张术由于可提供同质的薄、柔、有感觉的、血供良好的皮瓣，可使雕刻的外耳支架纤细结构充分展现，使再造耳更加逼真、自然,明显优于传统的方法[1-2]。但是，扩张皮瓣的破溃作为组织扩张术的并发症，是客观存在的，耳后扩张皮瓣破溃后，皮肤的完整性遭到破坏，是否有细菌入侵，目前尚未有相关的基础研究，但是已有临床研究观察到，扩张皮瓣破溃后可在某种程度上增加扩张过程中感染的发生率。另一方面，目前的观点是：若革兰士染色发现扩张包膜内有细菌存在，就避免放置永久性置入物，也就是说，外耳支架的受植床必须是无菌的，所以，研究扩张皮瓣破溃后的细菌状态就有非常重要的临床意义。

3.2 关于扩张皮瓣组织内细菌的研究 对于扩张皮瓣，主要是包膜内细菌存在与否，一直存在不同的观点[4]。根据我们大量的外耳再造临床实践证明，在扩张皮瓣保持完好的情况下，在正常的扩张注水无菌操作下，包膜腔内是处于无菌状态的。本实验在形成破溃动物模型时所做的细菌学检查亦在某种程度证实，扩张皮瓣完好的情况下，其受植床是无菌状态。对于扩张包膜内发现细菌存在的情况[4]，尚需进一步研究，或许Mason[5]报告的2例由于淋巴途径或血行途径导致的扩张器感染可以提供一点思路。

3.3 关于实验设计

3.3.1关于实验动物及部位的选择：兔是比较温顺和清洁的动物，兔的头部具有于人耳后乳突相似的解剖基础，保证了于临床的相似性；兔头部形成的扩张皮瓣位置固定，且不宜受到外伤，保证实验条件的对等性。

3.3.2关于取材：本实验取材分为两个阶段，其中第一阶段的目的是检测主体实验开始时，各组实验对象的实验条件是否一致，即细菌状态是否一致，并以此作为主体实验的对照。第二阶段是分部取材，因为破溃扩张皮瓣形成的创口，其底面是无机的、细菌不能通过的扩张器包囊，细菌只能通过创缘周围的皮瓣进入机体，进行增殖，引起局部炎症反应、或者播撒引起感染。因此，根据细菌的侵入途径，将整个扩张皮瓣进行分区，以明确细菌存在的方位。

3.3.3关于实验方法：目前，对于细菌学的检验，免疫组化、原位杂交和PCR等较高的特异性和敏感性的方法，仅限于对血液标本检测之用[6-7]，对于其他组织应用较少。国内外对临床标本中病原菌的检验大多仍采用本实验所用的方法--培养法这个“金标准”[8]。在定量检测方面国内外通用的Cooney法[3]。因此，总的来说，本实验选用的方法，是目前国内外临床上最为常用、可靠的方法。

3.4关于实验结果：本研究发现，扩张皮瓣破溃后，虽然革兰阳性菌是最常见的感染菌种（占45.5%），但同时亦有G－菌株和厌氧菌。细菌计数表明随着破口持续时间的延长，皮瓣组织内侵入的细菌数量是呈增长态势，因此在临床上，出现耳后扩张皮瓣溃破后，要快速封闭破口，同时为了预防或控制细菌繁殖，可联合应用敏感抗生素，处理严重感染时，应该意识到厌氧菌的存在，从而快速而有效地控制感染。

4 展望

本实验首次针对临床遇到的情况进行了相关研究，为临床医生处理此种情况提供了一定的参考，但是，本研究有其固有的局限性，如何寻求一种更为快捷、准确、易于临床应用的检查手段，是本研究的发展方向。

[参考文献]

[1]庄洪兴,蒋海越，潘博,等.先天性小耳畸形的皮肤软组织扩张器法外耳再造术[J].中华整形外科杂志，2006，12(4)：286-289．

[2]Jiang H，Pan B，Lin L,et a1．Ten-year experiencs in microtia reconstruction using tissue expander and autogenous cartilage[J]．Int J Pediatr Otorhinolaryngol, 2008，72(8)：1251-1259．

[3]张秀珍. 当代细菌检验与临床[M]. 北京：人民卫生出版社, 1999:231-33.

[4]Brown MH,Markus YM,Belchetz B. Microbial growth in saline breast implants and saline tissue expanders[J].Plast Reconstr Surg,2002,109(7):2242-2244.

[5]Mason AC,Davison SP,Manders EK.Tissue expander infections in children: look beyond the expander pocket[J].Ann Plast Surg,1999,43(6):539-541.

[6]Petyaev IM,Zigangirova NA,Petyaev AM,et al. Isolation of Chlamydia pneumoniae from serum samples of the patients with acute coronary syndrome[J]. Int J Med Sci,2010,7(4):181-190.

[7]Zhang X,Tani A,Kawai F,et al. Rapid and multiple in situ identification and analyses of physiological status of specific bacteria based on fluorescent in situ hybridization[J]. J Biosci Bioeng, 2010,110(6):716-719.

[8]D'Ercole S,Catamo G,Tripodi D,et al. Comparison of culture methods and multiplex PCR for the detection of periodontopathogenic bacteria in biofilm associated with severe forms of periodontitis[J]. New Microbiol,2008,31(3):383-391.

[收稿日期]2011-09-13 [修回日期]2011-11-22