用分型方法检测溯源副溶血性弧菌

【摘要】 目的 用分型的方法分析副溶血性弧菌的流行优势型，溯源其亲缘关系，为追踪感染源提供依据。方法 用诊断血清进行血清学分型，用PFGE和ERIC进行基因分型。结果 607株分离于海产品的VP分出10个血清群，有30株不能分型，分型率为94.64%，0：6群和0：5群为流行优势株；480株病人VP分为6个血清群，0：3群为流行优势株。377株分离于海产品的VP分成29个PFGE型；480株病人VP分成12个PFGE型。261株不同来源的VP分出42个ERIC基因型。结论 3种方法均能用于VP的分型，但各有特点。由于基因分型方法敏感性高、特异性强、分型率和分辨率佳的优点，将逐渐取代传统的表型分型技术。

【关键词】 副溶血性弧菌；血清学分型；PFGE分型；ERIC分型

1 资料与方法

1.1 菌株来源 收集食品来源的VP607株，病人和食物中毒VP480株，共计1087株。

1.2 试剂与仪器 ①试剂：TCBS琼脂为英国OXOID公司产品；弧菌显色培养基为科玛嘉产品；营养琼脂、碱性蛋白胨水等培养基为青岛海博生物技术有限公司产品；API20E生化鉴定试剂条为法国生物梅里埃公司生产；XbaⅠ酶购自大连宝生物公司。低熔点琼脂糖，PFGE级琼脂糖均为BIO-RID公司产品。蛋白酶K为MERCK公司产品。②主要仪器：CHEF MAPPER型脉冲场凝胶电泳仪（BIO-RID公司），VersaDoc型凝胶成像系统（BIO-RID公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株分离与鉴定 ①海产品和环境株VP分离采用筛检方法[2]；②腹泻病人菌株分离参照文献方法[3]；③菌株鉴定：用蔗糖、葡萄糖产气、6%NaCl胨水、阿拉伯胶糖4项对筛选可疑菌株进行复筛，凡阿拉伯胶糖阳性、葡萄糖不产气、蔗糖阴性、6%NaCl胨水生长的菌株，进一步作API20E生化系统鉴定，以区别其他弧菌和气单胞菌等细菌。

1.3.2 血清学分群[4] 按说明书操作。将1%氯化钠营养琼脂上的纯培养物，用生理盐水洗下，沸水浴煮沸20min，加热破坏菌体的K抗原，离心弃上清，然后用生理盐水洗涤3次，制成菌悬液，与副溶血弧菌“O”群分群血清作玻片凝集试验。

1.3.3 PFGE分型 参照美国PulseNet PFGE标准化方法[5]，①制胶块：2mlCSB（细胞悬浮液），挑取新鲜培养物，均匀悬浊，使菌液浊度至20%透射值。取200ul菌悬液至离心管中，37℃水浴5分钟，加入10ul蛋白酶K（20mg/ml），使其最终浓度为0.5mg/ml。置50℃水浴10min。将菌悬液与1%Gold Agarose（含1%SDS）等体积混合，将混合物加入模具孔中制成胶块，4℃10min冷却。②蛋白消化：3mlCLB（细胞裂解液）溶液加入15ul蛋白酶K（20mg/ml）（最终浓度0.1mg/ml），用模具梳子将胶块直接取出，投入CLB中54℃水浴2小时。弃液，加5ml50℃预热的纯水，轻摇至胶块悬起，50℃水浴轻摇10min，洗2次，5ml50℃预热的TE洗胶块4次，15min/次，凉至室温，加3mlTE，置4℃保存。③酶切：切1-3mm胶块，浸入150μl酶切体系中（其中含XbaⅠ酶50U），37℃过夜。④制胶：将酶切后的样品胶置于样品梳上，摆放到模具上。称取1gGold Agarose溶于100ml0.5×TBE液中，加热溶解后冷至60℃，缓缓倒入模具中，冷却20min后，拔去样品梳，去除挡板，将胶块放入已加入0.5×TBE缓冲液的电泳槽中。⑤电泳：电压6V/cm，电泳时间19小时，脉冲参数（2-10s，13h）：（20-25s，6h），电泳温度14℃。⑥染色：电泳结束后，将凝胶取出，用0.5μg/ml的Goldview染色30min，去离子水脱色30min。⑦读胶：用凝胶成像仪读胶分析。⑧结果判定：各菌株图谱间DNA条带数量和位置完全相同为同一型别，若有1条及以上的条带差别，即判为不同的型别，PFGE型别的排序是根据检测菌株发现电泳条带数目变化出现早迟排列，以阿拉伯数字表示。

1.3.4 ERIC-PCR分型[6] ①PCR模板制备：将副溶血性弧菌接种营养琼脂过夜培养，取菌落培养物悬浮于TNE缓冲液（10mM Tris，20mM NaCl，50mM EDTA，pH7.5），加入终浓度为0.5% SDS和100μg/ml proteinase K，55 C30 min，酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提DNA，异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤，用TE buffer（10mmol/LM Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8）溶解。②ERIC-PCR分型：采用Versalovic等报道的方法[7]。引物为5′-ATG TAA GCT CCT GGG GAT TCA C-3′和5′-AAG TAA GTG ACT GGG GTG AGC G-3′（上海塞百盛生物工程公司合成）。反应体系为：50μl总体积，10×PCR buffer（含Mg2+2.5mmol/L）5μl，引物各40pmol，dNTP各10μmol，Taq酶2.5单位，模版1μl。反应条件：94℃预变性3min，90℃变性30s，52℃退火60s，70℃延伸5min，共30个循环，最后70℃延伸10min，4℃保存。③结果判定型别的排序是依据检测菌株发现电泳条带数目变化出现早迟排列，减少或增加1条以上电泳条带变化的为1个ERIC型，对各型代表株条带采用丹麦Bionumerics4.6版软件进行聚类分析。

2 结 果

2.1 血清分型 对来源于腹泻病人和海产品等1087株生化反应典型的VP进行血清分群，其中607株海产品VP分为10个血清群，有30株不能分型，分型率为94.64%，流行优势血清群为0：6群和0：5群；480株病人VP分为6个血清群，流行优势血清群为0：3群，见表1。

2.2 PFGE分型 878株VP，经制胶、酶切、电泳后菌株的DN段得到良好分离，分为15-20个条带，各片段分子量在20-700kb之间。用丹麦Bionumerics4.6版软件进行聚类分析，377株海产品分为25个PFGE型，见图1；501株病人和食物中毒VP分为19个PFGE型，见图2，其中1型296株最多。经SPSS软件统计数据，作变量F分析处理，1型与其他PFGE型有统计学意义差异（P

2.3 ERIC-PCR分型 261株VP中141株来自海产品、水等，60株来自腹泻病人，60株来自多起食物中毒，其中病人粪便或肛拭50株、食品10株。食品和环境VP的ERIC-PCR多态性电泳条带，见图3；病人VP的ERIC-PCR多态性电泳条带，见图4。经聚类分析，分出42个ERIC基因型，见图5，18型最多。

3 讨 论

VP是一种通过污染/携带食品传播疾病的病原菌，因此，时关食品安全，被政府和公众关注。溯源是分析病原菌亲缘关系和追踪来源一种有效手段，通过发现流行优势型，为追踪传染源和疾病的防控提供依据，是疾病诊断的重在手段。传统的方法有生物分型（Biotype）、噬菌体分型（Phage typing）、血清分型（Serotyping）和蛋白图谱（PAGE）等，质粒图谱分析法（Plasmid analysis）和分子分型方法有制性片断多态性分析（RFLP）、扩增片断长度多态性分析（AFLP）、脉冲场凝胶电泳分析法（PFGE）、rDNA指纹图法（Ribotyping）、随机引物PCR法（RAPD）、多位点序列分析（MLST）、核酸序列分析法（16S rDNA and DNA sequencing）等。本文选择血清分型、PFGE和ERIC-PCR等3种常用方法进行比较，分析其实用性。

VP菌株的血清型与引起急性胃肠炎等疾病的暴发和散发有关联。根据VP的O和K抗原不同，可分成众多的血清型、群。始于1996年的印度的加尔各答的O3血清群是当前最主要的VP致病菌株[8]在上世纪代末已成为全球大流行的优势株[9]并一直保持到今，其高感染率和蔓延能力已引起各国的高度关注。在国内的研究也证实O3：K6型VP也是导致我国VP感染的优势株。我们从480病人分离株分出6个血清群，其中72.71%（349/480）的菌株是O3血清群，因此认为该血清群是腹泻病人的流行优势株，与文献报道一致。海产品VP分出10个血清群，与病人VP相比血清群较分散，其优势株为O6和O5血清群，与病人的流行优势株（O3血清群）不同，由此可见，海产品分离株VP的优势株与病人分离株中的优势株存在有差别，是否致病风险小些，有待进一步证实。但从海产品中检出一定数量的O3群和O4群等致病性VP的优势株，提示我们海产品仍有引起VP食源性疾病散发或暴发的能力，我们应加强监测。有30株海产品分离株VP不能分型，这有可能存在新的血清群，需作进一步分析。同时，该现象也说明使用成品鉴定血清有局限性，以及VP血清型的多样性。

PFGE分型由Schwarts和Cernter建立，采用定时改变电场方向的交变电源，可对100Mb范围内的DNA分子进行分析。由于PFGE是对细菌全染色体DNA进行分析，检测细菌的染色体结构特征，因此分析更准确、更稳定，不受表型性状的易变性带来的干扰，且能显示出菌株间微小差异因此。特异性高、重复性好、结果容易判读等优点，被认为是细菌分子流行病研究的“金标准”。PFGE分型结果显示，宁波地区海产品VP有29个型，上海海产品VP为25个型，每型之间有多条带型差异，根据Tenover的同源性判定标准，表明相互间遗传亲缘关系较远，其中1型菌株数最多（54/330），可定为PFGE优势株，其它各型在11-65株之间。与食物中毒病人株1-2个PFGE型和病人VP12个PFGE型相比，海产品VP的PFGE型别也较为分散，且分离到的O3和O4等血清群VP（致病性株）在PFGE型别的相关性不明显，这可能是环境株VP的特征，因此，我们认为海产品分离株VP大多数不会引起食物中毒或致病人腹泻，该结果与海产品VP带tdh、trh毒力基因较低结果相符，但确切的结论有待于进一步研究。

ERIC-PCR分型方法属基因外重复回文序列PCR，由Versalovic建立，利用了肠杆菌科及弧菌属等细菌的基因组中广泛分布着短重复序列（repetitive sequence）和它们在菌株、种、属水平上分布有差异及进化过程有相对保守性。ERIC-PCR是以细菌DNA中串联重复序列为引物，通过扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，在不同种属个体间表现为在染色体上存在的位置和拷贝数不同，可进行指纹图谱分析，以电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异。该技术实用性强、费用低、可再现性好，已在多种病原菌的鉴定、分类、分型上得到广泛应用。检测发现261株VP均能被分型，共分出42个型，其中18型和26型为优势型。从图5-8中可见，海产品分离株VP型别较多，较散，相关性较低。而病人中分离的VP，则反之，尤其是食物中毒菌株，大多只有1-2个型，结果显示ERIC-PCR分型方法能用于VP分型，发现优势基因型和菌株间亲缘关系的近远。由此可见，ERIC-PCR是一种有效的细菌基因分型方法，能够确定菌株间的亲缘关系，溯源其优势基因型，进而与毒力基因一起，探讨菌株间致病力的相关性。

总之，3种方法均能用于VP的分型，但各有特点。血清分型是一种从VP众多血清型中发现流行优势型而进行溯源的方法，由于流行优势株有动态变化特征，使血清分型变得复杂；其次是血清学分型显示的是表型特征，虽能区分致病株、了解流行优势型，但其可靠性和重复性不佳，分型率及分辨力不高，而且操作费时、技术复杂，只能提供感染依据，无法明确是否为同一起暴发事件，确定菌株间的亲缘关系，因此，不能用于传染源的追踪。第三，很多菌株当抗原位点受环境等因素的影响，发生突变出现新的血清型时就可能给食源性疾病流行病学调查和溯源带来困难，本文30株VP不能袜子分型也证明了这一点。因此，血清学虽能获得分型结果，但在追踪传染源以及确定暴发性感染菌株特征等方面受到了一定的制约，并非VP分型的最佳选择。PFGE和ERIC-PCR是一类从基因上对VP进行分型的方法，DNA所包含的遗传信息决定了不同种生物之间以及同种生物的不同亚种/株系之间的差异，故基因分型比传统方法更为准确，其敏感性、特异性、分型率和分辨力均极高，因而在现代VP分型中具有不可替代的作用。检测发现PFGE和ERIC-PCR确能有效地对VP进行分型，并能够精确确定菌株间的亲缘关系，提示我们PFGE和ERIC-PCR不仅能用于VP的分型，更重要的是对VP的溯源，探讨其优势基因型的亲缘性，与致病性的相关性。对VP进行分型方法有多种，适用范围因根据其各自的优缺点不同确定，以达到分型为目的。PFGE和ERIC-PCR与RFLP、血清学、生化分型，核糖体等分型方法比较，具有操作方便，可以大样本检测，分辨效果好，可重复性强的优点。ERICPCR分型比PFGE更加简捷，还可自动化分型，但需建立细菌ERIC-PCR分型标准数据库，而PFGE国内外已有分型标准数据库，其实用性优于ERIC-PCR。检测发现，如何提高各种方法的分型率和分辨力，建立和统一各种方法的标准操作规程，增强结果的可比性。在此基础上，迫切需要国内外同行合作，共同建立基因分型数据库，并共享信息，以促进VP分子流行病学研究发展。两种或多种分型方法的联合使用，将会使VP的分型更快、更准，但我们要根据自身实验室的条件选择相应的方法，为VP的准确溯源提供科学依据，有效预防和控制VP引起的腹泻及食物中毒事件。

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