UPLC法快速测定石杉碱甲片中石杉碱甲的含量

【摘要】目的：建立超高效液相色谱（uplc）法测定石杉碱甲片中石杉碱甲的含量。方法：采用UPLC法测定，ACQUITY UPLC？RBEH C18色谱柱，甲醇-0.1%乙酸铵溶液（30：70）为流动相，柱温：30℃，流速：0.4 mL.min-1，检测波长：310nm，进样量1μL。 结果：在1.5～10 ng范围内线性关系好（r=0.9999 ），平均回收率为100.11%，RSD=0.89%。结论：该方法准确度、精密度、稳定性及重现性好，可作为含量测定的可靠方法。

【关键词】石杉碱甲，含量测定，UPLC

前言：石杉碱甲片，其主要成份石杉碱甲。石杉碱甲是从我国中草药蛇足石杉中分离出的一种生物碱之一，为强效可逆性中枢乙酰胆碱酯酶抑制剂，主要用于治疗各种记忆障碍。经临床证明，其与喹硫平联合使用，对精神分裂症，阿尔茨海默记忆障碍有明显治疗作用。

超高效液相色谱（UPLC）与HPLC具有相同分离原理，但比传统的HPLC有更高的分离能力，对药物分析技术有极大促进作用。

本文建立UPLC法测定石杉碱甲片中石杉碱甲含量的方法，并进行方法学验证，结果显示该方法准确、精密、重复性及稳定性好，可作为含量测定的可靠方法。

1仪器与试剂

1.1仪器。超高效液相色谱仪（ACQUITY？RUPLC，美国Waters）：ACQUITY Biernary Solvent Manager系统，ACQUITY Sample Manager自动进样器，ACQUITY TUV Detector检测器，天平（XS205DU， Mettler Toledo）；0.22μm微孔滤膜（上海月旭）等。

1.2试剂。石杉碱甲对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100243-201202）；石杉碱甲片（河南太龙药业股份有限公司，生产批号131107；140404）；甲醇，乙腈（色谱纯、美国J.T.Baker）其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件。色谱柱为Acquity UPLC BEH C18色谱柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；流动相：甲醇-0.1%乙酸铵溶液（30：70）；流速：0.4mL.min-1；柱温：30℃；检测波长：310nm；进样量1μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备。精密称取石杉碱甲对照品10.23mg，置容量瓶中， 0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至200ml，摇匀，得对照品贮备液。精密量取贮备液5mL，置50mL容量瓶，用0.01mol/L盐酸稀释并定容，得5μg.mL-1的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备。

取石杉碱甲片20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于石杉碱甲100μg），置20mL容量瓶，加0.01mol/L盐酸适量，超声溶解，0.01mol/L盐酸稀释至刻度，摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液。

2.3 方法学考察

2.3.1专属性考察。

按上述色谱条件，分别取对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂各1μL注入色谱仪，结果显示石杉碱甲与其他组分可达到基线分离，说明样品中其他组分不干扰测定。UPLC色谱图见图1。

2.3.2 线性试验。取2.2.1项下石杉碱甲对照品溶液，过滤，依次进样0.3、0.5、1.0、1.5、2.0μL，按2.1项色谱条件进行测定，n=3。以进样量（ng）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，方程为：A=46837m+4662.4，（r=0.9999），结果表明石杉碱甲在1.5～10ng范围内具有良好的线性关系。

2.3.3精密度试验

取2.2.1项下石杉碱甲对照品溶液，过滤，每次进样1.0μL（n=6），测峰面积，RSD为0.14%，说明仪器精密度良好。

2.3.4稳定性试验

取含量测定项下石杉碱甲片供试品溶液，过滤，每隔2h进样1次，进样量1.0μL，测峰面积，RSD=0.61%（n=6）。说明供试品溶液在10h内具有良好的稳定性。

2.3.5重复性试验

取同批号样品，按2.2.2项所述供试品溶液制备方法配制石杉碱甲片供试品溶液6份，过滤，分别注入样品瓶，取1.0μL进样，测峰面积，RSD=0.76%，说明重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验

精密称取已知含量的石杉碱甲供试品药粉3份，按标示量的100%加入2.2.1项制备的对照品溶液，制备加样回收供试品溶液。按2.1项色谱条件测定，平均回收率100.11%，RSD=0.89%，说明该方法具有良好的准确度。

2.4样品含量测定

随机取石杉碱甲片2批，抽取6份样品，按2.2.2项所述方法制备供试品溶液，取续滤液，按2.1项色谱条件测定，记录峰面积，计算石杉碱甲的含量（n=3），结果见表1。

3讨论

3.1方法选择

《中国药典》2010年版对石杉碱甲片的含量测定方法为HPLC法，以现行条件，配置样品浓度低，进样量较大，峰型易展宽，对色谱柱要求高，因此重限性较差。日常工作表明，每个样品单次检测时间约15min，完成含量测定约3.5h，而样品检查项下有关物质、含量均匀度及溶出度均需使用上述规定方法，故样品相关项目总检验时间约12h。

为提升检验效率与准确性，尝试采用UPLC法进行含量测定。通过探索条件并进行方法学验证，发现所建立的方法若用于日常检测，每份样品液相部分的总检验时间可从12h左右减至1h以内，大幅提升检测效率；同时可减少样品损耗，降低仪器空置率，值得推广研究。

3.2流动相的选择

曾对多种流动相进行选择，多次摸索后发现若水相换成可挥发的缓冲盐乙酸铵，并用乙酸调节pH至3.0，则可达到较好的分离度及峰型修饰效果，并通过进一步调节流动相比例，可快速出峰。因此最终选用甲醇-0.1%乙酸铵溶液（30：70）作为流动相。

3.3检测器的选择

在本所日常工作中，UPLC常与MS（AB Science 4000QTrap）进行串联使用，多用于各类中成药或保健品中的非法添加检测。依文献[5]，实际检测到的分子离子峰m/z为 243.100，选用MRM法，采样离子对243.100/210.100建立线性方程进行测定，结果其线性虽好，但重现性差。其原因可能是Q-Trap类质谱本身对于定量检测的缺陷所致，综合检测成本与方法学考虑，最终选用经典的UV检测器。

4结论

文章中建立的UPLC法测定石杉碱甲片中石杉碱甲的含量，其线性关系好、准确度、精密度、稳定性及重现性均符合要求，且该方法简便、高效，可作为含量测定的可靠方法。

参考文献 ：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[M].北京：化学工业出版社，2010：109-110.

[2]张文生.喹硫平联合石杉碱甲对精神分裂症记忆功能障碍的效果[J].今日药学，2014，24

（11）：831-833.

[3]李红忠，陈 玲，吴春喜.喹硫平合并石杉碱甲治疗阿尔茨海默病伴明显精神病性症状的疗效和安全性[J].中国民康医学，2014， 26（19）：23-24.

[4]赵 容. UPLC在药物分析中的应用.黑龙江医药，2014，27（2）：283-285.

[5]刘 骁，李 端，王小林，陈春麟.用高效液相色谱-质谱-质谱法测定小鼠血浆和大脑中的石杉碱甲及药动学[J]. 复旦学报（医学版），2006，02：247-250.

[基金项目] 河南省教育厅科学技术研究重点项目（14B350003）

[作者简介]李晓静，女，药师，研究方向化学药物质量控制及分析。

[通讯作者] 李强，男，主管药师，研究方向中药化学药物质量分析。