UPLC―Q―TOF―MS分析不同产地泥附子化学成分的差异

[摘要]附子是我国毒性中药的代表品种，具有较高的药用价值，同时也具有一定的安全风险。随着城市化进程的推进及产业转移升级，逐渐形成了传统道地产区与新兴产区并存的局面。不同产区在地理分布、生态环境及生长周期等方面的差异性，可能导致附子种内化学成分的变异，进而影响品质和疗效。然而，有关不同产区附子的化学特征成分尚缺少深入研究。应用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF-MS）方法对比分析传统不同产地附子的化学成分差异。结果表明，采用无监督的主成分分析（PCA），汉中附子与道地的江油附子成分相似，明显不同于新兴产区的布拖与巍山附子；运用偏最小二乘判别分析（PLS-DA），筛选发现7个主要差异化合物，其中新乌头碱与附子灵在布拖附子与巍山附子中含量较高，而次乌头碱、尼奥林、卡米查林、宋果灵等在江油附子与汉中附子中含量较高；结合各成分的毒性强弱，发现次乌头碱与新乌头碱是区分江油附子与布拖附子、巍山附子的关键毒性成分，江油附子毒性低于布拖附子与巍山附子。江油附子较低的毒性有利于保障临床用药安全，可能是附子道地性形成的重要原因之一。上述研究结果为从次生代谢产物多样性角度揭示附子道地性的形成机制提供了新的参考数据。

[关键词]附子；产地；毒性；特征成分；UPLC-Q-TOF-MS

[Abstract]As a representative variety of hypertoxic herbs， aconite has a very high medicinal value but certain security risks. With the advance of urbanization and industrial transfer and upgrading， traditional geo-authentic regions and emerging regions have gradually coexisted. However， there are significant differences in the geographical distribution， ecological environment and growing cycle in these areas， which may cause intraspecific variations in chemical components， and then affect herb quality and clinical efficacy. Furthermore， there was still lack of in-depth study on characteristic constituents of aconite genuineness. In this paper， an UPLC-Q-TOF-MS was used to investigate the chemical ingredients in Jiangyou aconite， Hanzhong aconite， Butuo aconite and Weishan aconite. The results suggested that using unsupervised PCA method， Jiangyou aconite was similar with Hanzhong aconite in chemical ingredients， but significantly different from ones in emerging regions. Using PLS-DA method， seven characteristic constituents were identified， in which Butuo aconite and Weishan aconite had higher contents of mesaconitine and fuziline， while Jiangyou aconite and Hanzhong aconite had higher contents of hypaconitine， neoline， carmichaeline， and songorine. Based on basic toxicity of each ingredient， we can find that hypaconitine and mesaconitine were the key toxicity factors to distinguish Jiangyou aconite， Butuo aconite， and Weishan aconite. The toxicity of geo-authentic Jiangyou aconite was lower than that of Butuo aconite and Weishan aconite. The lower toxicity in geo-authentic Jiangyou aconite was beneficial for ensuring clinical drug safety， which may be one of the important reasons for the formation of genuine aconite. These results provide new reference data to reveal the formation mechanism of genuine aconite from the perspective of plant secondary metabolite diversity.

[Key words]Aconitum carmichaelii； region； toxicity； characteristic constituent； UPLC-Q-TOF-MS

附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根，是确有疗效的毒剧药材，同时具有极高的临床治疗价值与用药安全风险。著名医家恽铁樵称其为“最难用，亦最有用”[1]，国外学者[2]也称之为“一个兼有治疗价值与不可预知风险的药物”。在我国，附子药材自唐代起便在绵州彰明（今四川江油）地区种植；明清时期，又在陕西汉中地区广泛种植。经数百年临床应用实践，江油附子质量上乘，被誉为道地药材[3]。

20世纪60年代起，江油、汉中等平原地区的种植面积不断萎缩，而陆续开辟了诸多新兴产区，其中，以四川布拖、云南巍山的种植面积广，产量大。据课题组2014年附子产区调研信息，新兴产区产量已超过道地产区，四川布拖也成为我国最大的附子产区。鉴于布拖、巍山等地在地理分布、生态环境、种植周期等方面也明显不同于江油地区[4-5]，不同产地附子的品质差异如何，能否等同替代使用，是亟需回答的科学问题。因此，本文采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of fight/maa spectrometry， UPLC-Q-TOF-MS）技术结合多变量模式识别方法主成分分析（principal component analysis， PCA）与偏最小二乘判别分析（pratial least squares discriminant analusis， PLS-DA），从化学成分角度对不同产地附子生药材化学成分开展系统评价，以期寻找差异化学成分，阐明不同产地附子“同种异质”的客观性。

1材料

所选的20份泥附子样品于2014年6―9月分别采于四川江油、陕西汉中、四川布拖、与云南巍山种植基地的不同地块，每个产区5份样品。不同产地附子样品的外观性状见图1。样品经302医院肖小河研究员鉴定为毛茛科植物乌头A. carmichaelii的子根，样品保存于全军中药研究所。

Agilent Technology 1290 Infinity UPLC超高效液相色谱仪，Agilent TechnologyiFunnel 6550 Q-TOF LC/MS四级杆串联飞行时间质谱，1290二极光阵列检测器（G4212A），Agilent Masshunter工作站；Gradient A10 Mill-Q 超纯水器（法国 Millipore 公司）；Sartorius-BS110S 1/1 000分析天平，1/10万分析天平（德国赛多利斯公司），台式冻干机（北京博医康实验仪器有限公司）。

2方法

2.1供试品处理泥附子洗净、切片后冷冻干燥，粉碎制备成粉末。精密称取粉末1 g，加入色谱级甲醇25 mL，超声提取25 min，放冷，补足失重，滤过，滤液稀释100倍，过0.22 μm微孔滤膜，制得供试品。

2.2色谱条件采用色谱柱Zorbax RRHD 300SB-C18 （2.1 mm×100 mm，1.8 μm），柱温30 ℃，流速0.3 mL・min-1，进样量1 μL，流动相A（0.1%甲酸水溶液）-B（0.1%甲酸乙腈溶液），梯度洗脱（0～1 min，2%B；1～2 min，2%～5%B；2～5 min，5%～11% B；5～10 min，11%～15% B；10～15 min，15%～30% B；15～20 min，30%～40% B；20～24 min，40%～50% B）。

2.3质谱条件采用电喷雾电离离子源（electrospray ionization， ESI），正离子模式检测，扫描范围m/z 100～900，毛细管电压3 500 V，锥孔电压1 000 V，离子源温度200 ℃，鞘气温度350 ℃，鞘气流速14 L・min-1，质量校正质荷比为TFANH4-Purine-HP 0921溶液（m/z 121.050 9，922.009 8[M+H]+）。

2.4数据处理[6]采用Agilent Mass Hunter 定性分析软件 B.05.00版本 （Agilent Technologies， Palo Alto， CA， USA）对正离子模式下的质谱原始数据进行处理。数据过滤参数：保留时间0～24 min，扫描范围100～1 000，匹配误差100 mDa，保留时间窗口0.3 min。数据导入SPSS 22.0中，采用非参数检验筛选差异化合物，以P

3结果

3.1UPLC-Q-TOF-MS鉴定结果供试品正离子模式下不同产地代表性样品总离子流色谱图见图2，代表性质谱图见图3。从主要离子碎片的丰度来看，m/z 365成分在江油附子中丰度较高，在布拖附子中丰度低；m/z 378，437，616成分在江油附子与汉中附子中明显丰度较高，在布拖附子与巍山附子中丰度较低；m/z 632成分在巍山附子中丰度高，在汉中附子中丰度最低。根据对主要成分的质荷比、极性、质谱碎片信息，并结合文献[7-10]，共推断30个主要成分的化学信息，分别为多根乌头碱、雷乌宁、森布星A、新乌头原碱、森布星B、卡米查林、塔拉他定、乌头原碱、宋果灵、海替生碱、展花乌头宁、附子灵、乙酰塔拉乌头胺、尼奥林、牛扁碱、codelphine、附子亭、塔拉乌头胺、dehydrodelcosine、14-O-乙酰塔拉乌头胺、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、北乌头碱、新乌头碱、10-OH-乌头碱、乌头碱、次乌头碱、翠雀碱与印乌头碱，具体鉴定结果见表1。

3.2PCA，PLS-DA多元统计分析结果及标志物研究经MassHunter处理后，共提取892个成分的有效数据。经SPSS软件非参数检验后，共提取出差异成分409个（P

为进一步简化区分道地江油附子与布拖附子、巍山附子化学成分的差异，将江油附子与汉中附子合并为第1组，布拖附子与巍山附子合并为第2组，采用PLS-DA模型进行分析，结果见图5。结果显示，R2X=0.696，R2Y=0.995，Q2=0.99，所建模型稳定可靠，内部验证预测能力强（Q2>0.9代表模型预测能力强）。从图5A可看出，江油附子、汉中附子与新兴的布拖附子、巍山附子能明显区分，图5B显示了409个因子的载荷图。采用排列实验进行外部模型验证，设定y变量的随机排列次数为100次，观察与原始y变量模型之间的差异，并对随机化产生的R2及Q2与原始累积的R2及Q2进行回归。结果显示，R2及Q2的斜率较大，与Y轴截距分别为0.3，-0.288，提示外部模型预测能力好，模型质量好，可以做后续的模型差异化合物寻找的前提[11-12]。将409个观察指标进行数据变换，以p为横坐标，p（corr）为纵坐标作图，得到S-plot，结果见图5D。在S-plot中，观察指标离原点越远，对2组样品的区分能力越强，越可能作为分组的差异化合物[13]。本实验中，共标定7个位于S曲线两端的指标，分别鉴定为新乌头碱（a）、附子灵（b）、尼奥林（c）、未知成分（d）、卡米查林（e）、次乌头碱（f）与宋果灵（g），鉴定结果及上述成分的LD50见表2。

提取7个差异成分在江油附子、汉中附子、布拖附子、巍山附子样品中提取离子流的峰面积，采用箱图作图，比较7个成分在不同产地附子样品中的含量丰度差异，结果见图6。结果显示，新乌头碱与附子灵在巍山附子、布拖附子中的含量明显高于江油附子与汉中附子，而尼奥林、未知成分、次乌头碱、卡米查林及宋果灵在江油附子中含量明显高于布拖附子与巍山附子。上述研究表明，尼奥林，卡米查林，次乌头碱与宋果灵是区分道地江油附子与布拖附子、巍山附子的重要差异成分；江油附子与汉中附子整体类似，宋果灵可作为区分两者的差异成分。

由于附子为剧毒药材，通过检索Pubmed Cheml Dplus毒性化合物数据库，比较6个成分的毒性强弱。6个差异成分中，除附子灵未检索到基础毒性数据外，新乌头碱、尼奥林、卡米查林、次乌头碱与宋果灵经小鼠腹腔注射的半数致死量（LD50）分别为0.213，150，298，1.01，485 mg・kg-1；表明新乌头碱的毒性最强，其次是次乌头碱，毒性约为新乌头碱的1/4.8（LD50的比值），而其余成分的毒性很弱，仅相当于新乌头碱毒性的1/700～1/2 300。上述研究提示，道地产区的附子与新兴产区附子在关键毒性成分新乌头碱与次乌头碱上存在量的差异，其真实毒性可能明显不同。将新乌头碱、尼奥林、卡米查林、次乌头碱及宋果灵的LD50进行倒数归一化处理，分别为0.824，0.001 17，0.000 589，0.174，0.000 362。将上述相对毒性系数乘以各成分的质谱信号丰度，得到毒力数值，并作热图，结果见图7。由图可看出，尼奥林、卡米查林与宋果灵的毒力并不强，附子的毒性主要由新乌头碱、次乌头碱主导。明显地，新乌头碱在布拖附子、巍山附子中的毒力强于在江油附子，而次乌头碱在江油附子中的毒力强于布拖附子与巍山附子。鉴于新乌头碱的实际含量高于次乌头碱，且基础毒性约为次乌头碱的4.8倍，布拖附子、巍山附子的毒性应强于江油附子。

4讨论

药用植物的质量主要是由其化学成分决定的。越来越多的研究发现，不同产地，甚至同一产地不同个体间化学成分具有变异性。有学者提出，道地药材正是因为具有次生代谢形成的独特的化学物质基础而发挥其良好疗效[14-15]。本文采用UPLC-Q-TOF-MS方法对附子化学成分进行了较为全面的评价，借助多元统计方法确定了不同产地附子的7个关键化合物，证实了不同产区附子在一些重要化合物的含量上确实存在量的差异，阐明了不同产地附子“同种异质”的客观性。

在已鉴定的6个差异化合物中，新乌头碱、次乌头碱、尼奥林与附子灵为C-19型生物碱，而宋果灵与卡米查林为C-20型生物碱。尼奥林、附子灵对于离体蛙心的强心作用并不明显[16]，但不同浓度的尼奥林、附子灵对戊巴比妥钠所致心衰细胞具有明确的保护作用，能增强心肌细胞的搏动节律，提高细胞的存活率[17]。宋果灵具有明确的镇痛作用，起效机制与体内阿片受体的结合有关[18]，而卡米查林的活性尚不明确。新乌头碱与次乌头碱既是主要毒性成分也是强心、抗炎、镇痛成分[19]，还是不同产区附子的关键毒性因子。两者的毒性机制相同，但毒性强弱存在一定差异；前者与乌头碱毒性相当，约为次乌头碱毒性的3～5倍，即次乌头碱的毒性较低，安全窗更宽[20]。由于江油附子中新乌头碱含量明显低于布拖附子与巍山附子，次乌头碱含量明显高于后者，而新乌头碱的毒性明显更强，故道地产区附子毒性低于新兴产区，这与课题组前期对不同产地泥附子的生物毒价分析结果一致[21]。道地产区附子毒性偏低，有利炮制加工过程中减毒作用的发挥，确保临床的用药安全。

不同产地的中药材在特定自然生态环境下长期趋异适应，可能引起调控次生代谢产物合成的关键基因、酶的表达差异，导致次生代谢产物累积规律发生变化。附子的传统道地产区位于四川盆地北部涪江两岸，土壤肥沃（主要为水稻土）而疏松，光热充足，气候潮湿，海拨500～600 m，适合附子的快速生长膨大，有利于成分的快速积累，因此每年6―7月即可采收。而新兴产区主要位于四川盆地南部的凉山州与云南西北部山区，海拨较高，在1 500～2 300 m，土壤类型以黄壤、紫壤为主，气候严寒，昼夜温差大，块根膨大与药效成分的累积较慢，因此每年9月中下旬才开始采收，生长时间比道地产区长约60～90 d[4]。此前，道地产区附子在生长过程中要经过严格的绞根、追肥等过程，附子个头大、产量高；而新兴产区种植粗狂，附子个头普遍偏小；但近几年，新兴产区也普遍引进了江油的种植技术，附子个头与产量大幅上升。因此，上述差异成分的含量差异主要与生长环境及生长周期有关。对于调控新乌头碱、次乌头碱等合成累积的关键基因、酶等，是否受温度等因素调节影响较大，目前尚缺乏相关研究，可作为下一步的研究对象，通过化学标志物与生态适宜性、生物合成研究相结合，揭示生态因子对成分形成规律的影响。

本文通过植物代谢组学研究，揭示了不同产地附子化学谱差异的客观性，发现了区分不同产区附子的7个差异化合物，整合基础毒性数据，发现了次乌头碱与新乌头碱是区分两者的关键毒性因素，江油附子毒性低于布拖附子与巍山附子。该结论对于探讨附子种质资源的种内变异具有重要意义，为从次生代谢产物多样性角度深入揭示附子道地性的形成机制提供了新的思路。

[参考文献]

[1]黄勤挽， 周子渝， 王瑾， 等. 中药附子传统质量评价方法沿革[J].亚太传统医药， 2011，7（6）：47.

[2]Singhuber J， Zhu M， Prinz S， et al. Aconitum in traditional Chinese medicine： a valuable drug or an unpredictable risk？[J].J Ethnopharmacol， 2009，126（1）：18.

[3]黄勤挽， 周子渝， 王瑾， 等.附子道地性形成模式的梳理与考证研究[J].中国中药杂志， 2011，36（18）：2599.

[4]赵润怀， 王继永， 孙成忠， 等. 基于TCMGIS-Ⅰ的道地药材附子产地适宜性分析[J].中国现代中药， 2006， 8（7）： 4.

[5]周海燕， 周应群， 羊勇， 等. 附子不同产区生态因子及栽培方式的考察与评价 [J].中国现代中药， 2010，12（2）： 14.

[6]薛英， 李晓伟， 李震宇， 等. 采用UPLC/Q-TOF MS与NMR代谢组学技术研究生长年限对远志药材质量的影响[J].药学学报， 2015， 50（3）： 340.

[7]马增春， 周思思， 梁乾德， 等.基于UPLC-TOF/MS分析人参附子配伍减毒的物质基础[J].药学学报， 2011，46（12）：1488.

[8]周思思， 马增春， 梁乾德， 等. 基于UPLC/Q-TOF-MS分析附子半夏配伍相反的物质基础[J].化学学报， 2012，70（3）：284.

[9]Zhu H， Wang C， Qi Y， et al. Rapid quality assessment of Radix Aconiti Preparata using direct analysis in real time mass spectrometry[J]. Anal Chim Acta， 2012，752：69.

[10]Jaiswal Y， Liang Z， Ho A， et al. Distribution of toxic alkaloids in tissues from three herbal medicine Aconitum species using laser micro-dissection， UPLC-QTOF MS and LC-MS/MS techniques[J]. Phytochemistry，2014，107：155.

[11]漆小泉， 王玉兰， 陈晓亚. 植物代谢组学： 方法与应用[M]. 北京： 化学工业出版社， 2011.

[12]Slupsky C M， Rankin K N， Wagner J， et al. Investigations of the effects of gender， diurnal variation， and age in human urinary metabolomic profiles[J]. Anal Chem， 2007，79（18）： 6995.

[13]张学儒， 王伽伯， 肖小河， 等. 大黄药材两种化学型对金葡菌生长代谢热动力学变化的影响[J].药学学报， 2010， 45 （9）： 1144.

[14]王璐， 丁家昱， 刘秀秀， 等. 附子中胺醇型二萜生物碱的鉴定及其强心活性研究[J].药学学报， 2014，49（12）：1699.

[15]Xiong L， Peng C， Xie X F， et al. Alkaloids isolated from the lateral root of Aconitum carmichaelii[J]. Molecules， 2012， 17（8）：9939.

[16]Yu V Nesterova， T N Povet′yeva， N I Suslov， et al. Analgesic activity of diterpene alkaloids from Aconitum baikalensis[J]. Bull Exp Biol Med，2014， 157（4）：488.

[17]Zhou G， Tang L， Zhou X， et al. A review on phytochemistry and pharmacological activities of the processed lateral root of Aconitum carmichaelii Debeaux[J]. J Ethnopharmacol， 2015，160：173.

[18]黄林芳， 郑司浩， 武拉斌， 等. 基于化学成分及分子特征中药材肉苁蓉生态型研究[J].中国科学： 生命科学，2014， 44（3）： 318.

[19]邓朝晖， 田孟良. 生附子中次乌头碱的含量测定及其道地性研究[J].中国实验方剂学杂志， 2012， 18（16）：61.

[20]张定遥 杨明， 韩雪， 等. 中药炮制工艺研究新策略：个性化炮制与过程控制论[J]. 中国中药杂志，2015，40（17）：3323.

[21]张定遥 王伽伯， 杨明， 等. 中药品种整合评控实践：附子品质综合指数[J].中国中药杂志， 2015，40（13）：2582.