人类TSLC1基因克隆及真核表达载体的构建

作者：李文涛 周闯 赵永福 马秀现 张水军 【摘要】

目的： 克隆人类TSLC1基因并构建其真核表达载体pcDNA3.1(+)/TSLC1. 方法： 从正常皮肤组织中提取总RNA，采用RT?PCR方法扩增TSLC1基因全长cDNA，克隆入pMD18?T载体并转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切鉴定均为阳性的克隆，进行核苷酸测序分析，再将TSLC1基因定向克隆入pcDNA3.1(+)载体中构建表达载体. 结果： RT?PCR扩增后的产物在约1413 bp处出现明显的特异性条带，TSLC1基因的cDN段被成功插入真核表达载体pcDNA3.1(+)质粒的多克隆位点，经鉴定与GenBank收录的TSLC1 cDNA 序列一致. 结论： TSLC1基因的cDN段被成功克隆，为以后的研究奠定了基础.

【关键词】 TSLC1基因 pcDNA3.1 (+) 克隆 分子

0引言

肺癌肿瘤抑制物1 (tumor suppressor in lung cancer 1, TSLC1)，翻译产物是442个氨基酸的跨膜蛋白，该蛋白属于免疫球蛋白超家族成员之一［1］. TSLC1基因在肺癌、鼻咽癌、前列腺癌和宫颈癌均有不同程度的低表达异常，TSLC1不仅在诱导细胞周期的停滞及细胞凋亡中起重要作用，还在调节细胞黏连、迁移等生理功能中发挥重要作用［2］. TSLC1从发现至今时间尚短，所以目前国内外对TSLC1基因及其表达产物的研究报道不多，国内尚未克隆出TSLC1基因. 本研究我们克隆出了人TSLC1基因的cDN段, 其中包含有全长的蛋白编码区, 并将其插入真核表达载体，为后续将进行TSLC1对肿瘤相关功能的研究奠定基础.

1材料和方法

1.1材料皮肤组织来源于本院行包皮环切术的患者. 质粒pcDNA3.1(+)（美国Invitrogen公司）；E.coli JM109菌株为本实验室保存. RPMI1640培养基、胎牛血清（Gibco公司）；TRIzol试剂（Invitrogen公司）；限制性内切酶BamHⅠ, NotⅠ, One Step RNA PCR Kit (AMV)，pMD18?T vector, T4 DNA连接酶（TaKaRa公司）；MarkerⅢ, Ⅳ, Ⅶ（天为时代公司）；PCR扩增仪(T1, Whatman/Biometra公司)；超速冷冻离心机(400R, Heraeus公司)；恒温孵育箱(79?B?60，吉林农安柴岗医疗器厂). ABI3100自动测序仪（ABI3100，ABI公司）.

1.2方法

1.2.1RNA提取取液氮中保存的组织样品约100 mg，按Trizol试剂说明书提取总RNA.

1.2.2PCR引物的设计与合成根据GenBank发表的TSLC1序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计引物. 上游引物序列: 5′?GGA TCC ATG GCG AGT GTA GTG?3′，下游引物序列:5′?GCG GCC GCC TAG ATG AAG TAC TCT TTC TTT?3′. 分别在上游引物和下游引物的5′末端引入了限制性核酸内切酶BamHⅠ和NotⅠ识别序列，引物由北京赛百盛生物工程公司合成.

1.2.3RT?PCR使用一步法反转录试剂盒完成RT?PCR反应，反应体系50 μL，反应条件：RT反应，50℃ 30 min；RTase失活，94℃ 2 min；94℃变性，30 s；55℃退火，30 s；72℃延伸，6 min；30次循环. 反应结束后取PCR产物6 μL进行琼脂糖电泳检测.

1.2.4TSLC1的克隆及鉴定取PCR产物100 μL进行琼脂糖电泳并回收纯化目的cDN段，对回收产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定. 用回收的目的cDN段作为插入片段，按pMD18?T vector kit说明书进行连接反应，于16℃条件下连接30 min，在4℃条件下连接过夜，构建重组质粒pMD?TSLC1，将重组质粒转化入感受态JM109受体菌中，将转化的受体菌涂布在含50 mg/L氨苄青霉素的LB培养板上并进行蓝白筛选，37℃培养16 h. 从LB培养板上随机挑取单菌落，接种于氨苄青霉素的LB培养液中，37℃震荡培养过夜，从菌液中提取质粒进行PCR反应，挑选阳性克隆进行酶切鉴定，自动测序仪测序，用chromas软件分析测序结果.

1.2.5真核表达载体的构建及鉴定分别用测序正确的重组质粒和质粒pcDNA3.1(+)进行BamHⅠ，NotⅠ双酶切，酶切产物用8 g/L琼脂糖凝胶电泳，回收约1413 bp的TSLC1片段和5400 bp的pcDNA3.1(+)片段，将线性化的载体片段与回收的TSLC1片段用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，连接产物转化JM109感受态细胞，采用氨苄抗性筛选，挑取阳性克隆扩增并小量提取质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定［3］.

2结果

2.1总RNA的提取提取的总RNA进行甲醛变性电泳，有2条明显的电泳条带，分别对应28S，18S，A260 nm/A280 nm在1.8～2.0之间，表明获得的RNA完整无降解，满足下一步实验要求.

2.2RT?PCR利用自行设计的一对引物，通过RT?PCR方法从上皮组织中扩增出一条长度约为1413 bp的单一条带, 与理论预计的cDNA 片段长度一致(图1) .

2.3PCR产物的克隆及鉴定将回收的TSLC1扩增片段克隆入pMD18?T，转化入JM109受体菌，小提质粒，用特异引物进行PCR反应（图2）. 再选取PCR呈现阳性的质粒进行BamHⅠ和NotⅠ双酶切（图3）. 对鉴定为阳性的重组质粒进行测序的结果表明克隆的DN段与GenBank收录的TSLC1 cRNA 序列(序列号：AY358334) 完全一致.

2.4真核表达载体的构建及鉴定将pMD?TSLC1重组质粒和pcDNA3.1(+)载体分别进行限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ双酶切后分别回收约1413 bp的TSLC1片段和5400 bp的载体片段，将两者连接重组质粒，PCR增出一条长度约为1413 bp的单一条带、双酶切后电泳可观察到有约1413 bp的TSLC1条带和5400 bp的pcDNA3.1(+)条带和测序鉴定结果表明克隆的DN段与GenBank收录的TSLC1序列完全一致(图4).

3讨论

1998年Murakami等［4］发现，在79个非小细胞肺癌患者中，有25个患者的染色体在11q23处出现杂合性缺失，推测该处可能为抑癌基因缺失，并分离出一段1600 bp的基因片段，转染非小细胞肺癌细胞株A549，导入裸鼠体内后能够明显抑制肿瘤细胞的生长. Kuramochi等［5］分析并证实了在人染色体11q23.2处有一新的抑癌基因片段，它能较强地抑制非小细胞肺癌细胞株的生长，并命名为TSLC1基因. 数据显示91%的宫颈癌细胞株TSLC1缺失，82%宫颈癌细胞株TSLC1启动子甲基化［6］. 研究表明TSLC1不仅在诱导细胞周期的停滞及细胞凋亡中起重要作用，还在调节细胞黏连、迁移等生理功能中发挥重要作用，TSLC1基因作为抑癌基因家族新的成员, 为抑癌基因的研究注入了新的活力.

我们在TSLC1开放阅读框附近设计了一对具有酶切位点的引物，扩增出长度为1400 bp的产物，克隆入pMD18?T载体上并转化大肠杆菌JM109，经PCR,酶切鉴定均为阳性的克隆，进行核苷酸测序分析，测序分析正确后，构建TSLC1真核表达载体pcDNA3.1(+)/TSLC1，并进行PCR、双酶切和测序鉴定，准备以此为开端对TSLC1基因作更加深入的研究，这些工作为以后进一步研究TSLC1对肿瘤相关功能的研究奠定了基础.

【参考文献】

［1］ Daisuke Y, Midori Y, Yuko NW, et al. Disruption of spermatogenic cell adhesion and male infertility in mice lacking TSLC1/IGSF4, an immunoglobulin superfamily cell adhesion molecule［J］. Mol Cell Biol, 2006,26: 3610-3624.

［2］ Eriko F, Yoriko K, Satomi O, et al. Oligo?Astheno?Teratozoospermia in mice lacking RA175/TSLC1/SynCAM/IGSF4A, a Cell adhesion molecule in the immunoglobulin superfamily［J］. Mol Cell Biol, 2006,26:718-726.

［3］ 张绍荣,杨晓强,邢锐,等. 三叶因子2基因真核表达载体的构建［J］. 第四军医大学学报,2006,27 (1):57-58.

［4］ Murakami Y, Nobukuni T, Tamura K, et al. Localization of tumor suppressor activity important in non?small cell lung carcinoma on chromosome 11q［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1998, 95: 8153-8158.

［5］ Kuramochi M, Fukuhara H, Nobukuni T, et al. TSLC1 is a tumorsuppressor gene in human non?small?cell lung cancer［J］. Nat Genet, 2001,27:427-430.

［6］ Steenbergen RD, Kramer D, Braakhuis BJ, et al. TSLC1 gene silencing in cervical cancer cell lines and cervical neoplasia［J］. J Natl Cancer Inst， 2004, 96: 294-305.