10%尿素乳膏微生物限度检查方法适用性试验的研究

摘要：目的 建立10%尿素乳膏的微生物限度检查方法。方法 常规法。结论 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数采用常规的平皿倾注法，控制菌的检查采用常规法。

关键词：10%尿素乳膏；微生物限度检验法；方法适用性试验

Study on the Aapplicability Test of Microbial Limits Test of 10% Urea Cream

FANG Min

（Institute for Food and Drug Control，Suzhou 234000，Anhui，China）

Abstract：Objective To establish microbial limit test for 10% urea cream .Methods Common method.Conclusion Routine pour-plate method was used for the total aerobic microbial count，total yeasts and mold count. The conventional method can be used for the test of control bacteria.

Key words：10% urea cream； Microbial limits test；Applicability test

尿素乳膏，为皮肤外用药。适用于皮肤角化症，手足皲裂，干皮症、鱼鳞病等。为保证所采用的检验方法适合于该药品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数以及控制菌的检查，确认供试液制备、测定方法及检测系统适用于该药品的检验，本文参照《中国药典》[1]2015年版第三部通则"1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法"以及"1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法"、《中国药品检验标准操作规范》[2]，建立10%尿素乳膏微生物限度检验方法并进行方法适用性试验，结果报道如下。

1 资料与方法

1.1试验环境 根据2015年版《中国药典》第三部"9203药品微生物质量管理原则"[3]规定，试验在环境洁净度B级、局部洁净度A级的单向流空气的无菌室进行，阳性菌操作在符合国家Ⅱ级生物安全标准的生物安全柜内进行。

1.2实验仪器 MJX-160B-Z型微电脑霉菌培养箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、DYX-DHS型隔水式电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械厂）、GHP-9162型电热恒温培养箱（上海金慧科电子有限公司）、BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（苏州苏净仪器自控设备有限公司）、YXQ-LS-75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器（上海市博讯实业有限公司医疗设备厂）、TZQ-Ⅱ型匀质器型号（天津市津德实验仪器技术开发中心）。

1.3供试品 10%尿素乳膏，宿州亿帆药业有限公司（批号：160101，160102，160103）。

1.4稀释剂 0.1%无菌吐温溶液、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（自配）。

1.5培养基 胰酪大豆胨液体培养基（TSB）（批号为20151211

0-00）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）（批号为20160111-00）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）（批号为20151110-00）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号为20150716-00）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号20151026-00）。以上均由杭州微生物试剂有限公司提供。

根据2015年版《中国药典》第三部通则的规定，计数培养基符合计数培养基适用性检查的要求；控制菌检查用培养基符合促生长能力、抑制能力及指示特性的要求。

1.6试验菌种 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B） 63 501]、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26 003]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B） 10 104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F） 98 003] ，试验用菌株的传代次数为3代。

所用菌种，黑曲霉菌由中国药品生物制品检定所提供，其余菌种均由中国医学菌种保藏中心提供。

2 结果

2.1菌液的制备与检验

2.1.1菌液的制备 取经35℃培养18～24 h的枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的TSB培养物1 ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释，枯草芽孢杆菌至10-5、铜绿假单胞菌至10-6、金黄色葡萄球菌至10-8，备用；取经25℃培养2～3 d的白色念珠菌液体培养物1 ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-5，做活菌计数备用；取经25℃培养1 w的黑曲霉斜面培养物，加4ml pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子悬液1 ml，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10倍递增稀释至10-6，做活菌计数备用。

2.1.2菌液的检验 取2.1.1铜绿假单胞菌10-6、枯草芽孢杆菌10-5、金黄色葡萄球菌10-8、白色念珠菌10-5稀释液及上述黑曲霉10-6孢子悬液各0.1 ml，分别用45℃胰酪大豆胨琼脂培养基20 ml注皿，各平行测定两皿，铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌30℃～35℃培养3 d，计数；白色念珠菌、黑曲霉30℃～35℃培养5 d，计数，均应不大于100cfu；取上述白色念珠菌10-5稀释液及上述黑曲霉10-6孢子悬液各0.1 ml，分别用45℃沙氏葡萄糖琼脂培养基20 ml注皿，各平行测定两皿，20℃～25℃培养培养5 d，计数，均应不大于100cfu。试验结果见表1，符合要求。

2.2供试液制备 随机取两支供试品（10g/支），混合，按非无菌产品微生物限度检查法供试品检查规定称取10g，加40℃无菌0.1%吐温溶液至100 ml，用匀浆仪混和均匀，即为1：10的供试品溶液。

2.3需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的适用性试验 采用常规法（即平皿倾注法）进行3次独立的平行试验。

2.3.1试验组：取1：10供试液10 ml，加上述试验菌液0.1 ml，使每1 ml供试液中含菌量不大于100cfu，取供试液1 ml，置直径90 mm的无菌平皿中，立即注入15～20 ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固后置规定温度培养3～5 d，逐日观察结果并记录。

2.3.2菌液对照组：取稀释液代替供试液，按试验组操作。

2.3.3供试品对照组：取制备好的供试液，以无菌0.1%吐温溶液代替菌液同试验组操作。

2.3.4阴性对照：取无菌0.1%吐温溶液1 ml置90 mm的无菌平皿中，立即注入15～20 ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固后置规定温度培养3～5 d，逐日观察结果并记录。

2.3.5实验结果：试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值与菌液对照组平均菌落数的比值应在0.5～2范围内。结果见表2、表3（结果为两皿的平均值）。

从表2、表3可以看出3次平行试验，试验组的菌落数减去供试品对照组的菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均在0.5～2范围内。

2.4控制菌检查方法的适用性试验 铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查方法的适用性试验：按常规法进行三次平行试验。

2.4.1试验组：分别取1：10供试液10 ml及上述不大于100cfu的铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌1 ml，分别接种置90 ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置35℃培养18～24 h，按相应的控制菌检查法检查。

2.4.2菌液对照组：取稀释液代替供试液，同试验组操作。

2.4.3供试品对照组：取1：10供试液10 ml，以无菌0.1%吐温溶液代替菌液同试验组操作。按相应的控制菌检查法检查。

2.4.4阴性对照组：取无菌0.1%吐温溶液11 ml，接种置90 ml胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，置35℃培养18～24 h，按相应的控制菌检查方法检查。

2.4.5 实验结果：控制菌检查方法适用性试验结果见表4。

由表4方法适用性试验结果可以看出铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌菌液对照组、试验组生长良好，说明尿素乳膏对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌无抑菌作用或抑菌作用较弱。

3 讨论

3.1由上述验证结果可知，在需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数检查的方法适用性试验中，常规法对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收试验均符合要求（即试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值均在0.5～2范围内）；从表4可以看出控制菌铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌的检查可采用常规法。

3.2为防止阳性菌造成的环境污染，涉及阳性菌的试验均在阳性室的生物安全柜内操作。

3.3方法适用性试验需进行三次平行的独立实验，所加的培养基体积应尽量一致，培养基与所加试液应充分混合均匀。

3.4乳膏供试品不易混和均匀，故实验过程中采用匀浆仪进行搅拌混合。

参考文献：

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].中国医药科技出版社，2015年版三部：通则80-通则90.

[2]中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范[S].中国医药科技出版社.2010年版：351-369.

[3]国家药典委员会编.中华人民共和国药典[S].中国医药科技出版社，2015：220-221.编辑/金昊天