雷公藤4―(5′―二磷酸胞苷)―2―C―甲基―D―赤藓醇激酶基因的全长克隆与表达分析

[摘要] 4-（5-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶[4-（cytidine-5-diphospho）-2-C-methyl-D-erythritol kinase， CMK]是雷公藤甲素等萜类成分生物合成途径上关键酶之一。根据获得的雷公藤转录组数据中TwCMK片段设计特异性引物，采用全长PCR方法克隆TwCMK全长cDNA，并进行生物信息学分析；采用实时荧光定量PCR （RT-qPCR）检测茉莉酸甲酯 （MeJA） 诱导雷公藤悬浮细胞后0～72 h TwCMK基因的表达水平。结果表明，TwCMK全长cDNA由1 732个核苷酸组成，具有完整的开放阅读框，共编码387个氨基酸，蛋白相对分子质量为42.85 kDa，理论等电点为5.79；TwCMK基因受MeJA诱导后表达逐渐上升，在24 h时达到最高值。为进一步研究雷公藤甲素等萜类成分次生代谢调控和生物合成奠定了基础。

[关键词] 雷公藤；4-（5-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶（CMK）；生物信息学分析；表达分析

[Abstract] 4-（Cytidine-5-diphospho）-2-C-methyl-D-erythritol kinase is a key enzyme in the biosynthesis pathway of terpenoids. According to the transcriptome database， the specific primers were designed and used in PCR. The bioinformatic analysis of the sequenced TwCMK gene was performed in several bioinformatics software.The Real-time fluorescence quantification polymerase chain reaction （RT-qPCR） were used to detect the expression levels of TwCMK from T. wilfordii after elicitor MeJA supplied. The results showed that the full length of TwCMK cDNA was 1 732 bp encoding 387 amino acids. The theoretical isoelectric point of the putative TwCMK protein was 5.79 and the molecular weight was about 42.85 kDa. MeJA stimulated the rising of TwCMK expression in suspension cell and signally impacted at 24 h. The research provides a basis for further study on the regulation of terpenoid secondary metabolism and biological synthesis.

[Key words] Tripterygium wilfordii； 4-（cytidine-5-diphospho）-2-C-methyl-D-erythritol kinase； bioinformatics analysis； expression analysis

doi：10.4268/cjcmm20152109

萜类化合物是自然界中种类非常丰富的一类化合物，由异戊二烯单元以各种方式连接、环化形成。异戊二烯在植物体内有2种合成途径，细胞质中的甲羟戊酸途径 （MVA） 和质体中的非甲羟戊酸途径（MEP）。4-（5-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶[4-（cytidine-5-diphospho）-2-C-methyl-D-erythritol kinase，CMK或IspE]是位于MEP途径上第4个关键酶，同时也是MEP途径上唯一的激酶。在CMK作用下，4-（5-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤藓醇（CDP-ME）磷酸衍生化，生成4-（5-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸 （ME-CPP）[1]。目前已经从丹参[2]，杜仲[3]，银杏等[4]等植物中克隆得到CMK基因。Wada等[5]在对嗜热菌HB8中CMK功能的研究中，发现CMK是致病微生物异戊二烯合成所必须的基因；而且CMK酶的结构域甲羟戊酸激酶和丝氨酸激酶结构相似，具有相同的活性位点残基Lys8 and Asp125。作为MEP途径上独有的激酶，CMK在调控萜类化合物合成中起着非常重要的作用。

雷公藤Tripterygium wilfordii Hook. F.是卫矛科雷公藤属植物，其干燥根或根的木质部作为药材雷公藤使用，临床上多用于类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫疾病的治疗[6]。雷公藤甲素和雷公藤红素是雷公藤植物中主要的活性成分，具有较强的免疫抑制作用；更重要的是，其抗肿瘤活性也非常突出，是近几年来的研究热点。Liu等[7]综述了雷公藤甲素多种药理作用及水溶性雷公藤甲素衍生物是安全有效的抗肿瘤制剂。Griffit等[8]在研究晚期肾细胞癌过程中发现雷公藤甲素对转移性肾细胞癌有治疗作用。Chen等[9]结合放射疗法提高了雷公藤甲素对口腔癌的治疗作用。

本研究以雷公藤悬浮细胞为材料，通过全长PCR的方法从中克隆TwCMK全长cDNA序列，然后对CMK核酸序列和氨基酸序列进行生物信息学分析；同时，利用实时荧光定量PCR检测MeJA诱导雷公藤悬浮细胞后72 h 内TwCMK基因的表达水平，为进一步研究雷公藤甲素和红素类成分的次生代谢调控和机理提供了靶基因。

3 结果

3.1 雷公藤TwCMK基因的全长克隆及序列分析 通过全长PCR克隆TwCMK全长cDNA，见图1。将所得全长序列进行Blastx比对和ORF Finder 在线分析，测得的序列与其他植物的CMK基因有较高的同源性并且存在完整的开放阅读框。获得全长为1 732 bp的 cDNA序列，开放阅读框位于211～1 374 bp，推测编码387个氨基酸。Blastx结果显示TwCMK序列与美丽帽柱木的同源性为84%，黄瓜同源性为83%，巨桉同源性为82%，可可树同源性达82%，见图2。TwCMK具有较保守的结构域，在DNAMAN 8.0软件中对可可树 （TcCMK， XP_007015325.1），拟南芥 （AtCMK， AEC07908.1），长春花 （CrCMK， ABI35992.1），苜蓿（MtCMK， KEH33384.1），金银花 （LjCMK， AGE10581.1），丹参（SmCMK， ABP96842.1），葡萄 （VvCMK， XP_002267319.2），胡黄连（PkCMK， AFKM93780.1）的氨基酸序列进行多重序列比对，结果表明TwCMK与其他植物的CMK氨基酸序列具有较大的同源性，平均为78.72%。 Interpro 结构域比对结果显示TwCMK具有IspE功能域，见图3。

3.2 TwCMK氨基酸序列的系统进化分析 将TwCMK氨基酸序列与Genbank中其他植物的氨基酸序列进行比对，并在MEGA5.1中构建系统进化树，进行聚类关系分析，见图4。其中藻类、苔藓、单子叶植物、双子叶植物聚成单独的分支；TwCMK归类于双子叶植物分支，与可可树CMK序列聚为一类，二者在亲缘关系较近。

3.3 TwCMK氨基酸理化性质和3D结构预测 ExPASy在线软件Compute PI/Mw Tool预测TwCMK蛋白的相对分子质量为42.85 kDa，理论等电点5.79。信号肽分析表明TwCMK是非分泌蛋白，无信号肽；亚细胞定位结果显示定位于叶绿体；跨膜域分析显示TwCMK位于膜外，不存在跨膜螺旋。PredictProtein预测TwCMK蛋白的二级结构组成，其中无规则卷曲占50.13%，α-螺旋结构占30.49%，β-折叠占19.38%。蛋白质的功能很大程度上与空间结构紧密相关，TwCMK蛋白的三级结构建模是以大肠杆菌CMK单体为模板[13]，见图5。序列同源性达44.74%，用于建立该模型的氨基酸去除叶绿体转运肽，为50～387位。

3.4 MeJA诱导表达分析 实时荧光定量PCR （RT-qPCR）检测，MeJA诱导后0，1，4，12，24，48，72 h的雷公藤悬浮细胞TwCMK相对表达量。利用7500 Software v2.0.1软件分析，扩增过程中溶解曲线峰形单一，显示内参引物和目的基因引物特异性强；扩增曲线的Ct均介于25～35，引物扩增效率较高。随后对所有样品的Ct进行2-ΔΔCt方法分析，得到不同时间段MeJA诱导TwCMK相对表达量，见图6。结果表明，MeJA诱导子能显著提高TwCMK基因的表达量，在24 h时表达量达到最高，随后基因的表达量逐渐回复，在72 h时降至正常水平。

4 小结

雷公藤不仅作为中药饮片使用，其根部去2层皮后提取的混合物――雷公藤多苷在临床上应用非常广泛。为了满足临床上对雷公藤的需求，目前福建、浙江等地已建立雷公藤种植基地；另一方面，随着近年来雷公藤不定根、悬浮细胞、毛状根等遗传体系的建立，对雷公藤次生代谢产物合成的含量、调控的研究越来越多。李琰等[14]研究了雷公藤愈伤组织的培养条件，如碳源、植物生长调节剂等对次生代谢产物含量的影响；冯慧娜，祝传书等[15-16]研究了雷公藤发状根和胚状体中雷公藤甲素的含量。但是，影响悬浮细胞、不定根等遗传体系的次生代谢产物含量的不仅仅有外在的培养条件，生长调节剂；还有次生代谢产物合成途径上的关键酶基因。目前，尚未有雷公藤甲素类成分次生代谢相关的MEP途径上CMK功能基因报道。本研究首次克隆得到了雷公藤MEP途径上4-（5-焦磷酸胞苷）-2-C-甲基-D-赤藓醇激酶 （TwCMK） 基因 cDNA全长。CMK是MEP途径上唯一的激酶，对于异戊二烯C5前体的合成有重要作用。生物信息学分析进一步验证了该基因系CMK家族基因，具有IspE功能域，与其他植物的CMK基因有高度同源性。MeJA诱导悬浮细胞后，TwCMK基因的表达量迅速上升，在24 h达到最大值。本研究为MEP途径上关键酶基因的调控、雷公藤甲素类次生代谢产物的调控提供基因元件，从而为深入研究次生代谢调控机制，萜类活性成分生物合成及代谢工程奠定了基础。

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