荧光定量PCR用于献血者筛查的意义

［摘 要］ 目的：探讨高灵敏度荧光定量PCR用于筛查献血者HBV的意义。方法：对400例HBsAg ELISA法阴性的献血者标本用荧光定量PCR测定HBV?DNA进行对比。结果：400例标本中有5例HBV?DNA阳性，占1.25%。结论：荧光定量PCR用于献血者的HBV筛查，与ELISA法相比可有效地减少漏检，显著提高血液质量，降低经输血传播HBV的可能性。

［关键词］ 献血者；荧光定量PCR；筛查

对于输血安全问题，国家制定了相应的法律法规进行管理，并对献血者进行了很严格的筛查。现在患者出现输血后感染性疾病的风险已达到了非常低的程度，但这并不意味着就没有风险，尤其是输血后HBV的感染，风险远高于HCV和HIV感染的风险，这主要是由于我国HBV人群感染率高，病毒的变异及检测方法的灵敏度等原因导致HBV的漏检而造成的。我们运用荧光定量PCR方法对400例HBsAg ELISA法阴性的献血者血清标本进行HBV?DNA检测，探讨了荧光定量PCR在对献血者筛选中的意义 ，结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 标本 全部来自长沙市中心血站筛检合格的献血者，共400份，HBsAg ELISA法阴性。

1.2 试剂 荧光定量PCR试剂盒由达安基因股份公司提供。

1.3 仪器 美国PE 5700全自动荧光定量PCR仪。

1.4 方法 HBV?DNA提取：血清50 μl加入DNA提取液50 μl，混匀，沸水浴10 min，然后4 ℃放置4 min~6 min。HBV?DNA提取管12 000 r离心5 min，取上清液2 μl加入荧光定量PCR反应管中，将各阳性标准品、阴性对照、待测样品的PCR反应管一起置于PCR仪中检测。扩增条件：93 ℃ 2 min预变性，然后93 ℃ 30 s ，55 ℃90 s ，共计40个循环。根据纯化HBV?DNA标准品建立直线回归方程，仪器软件自动分析出定量结果，拷贝数>1 000/ml判为阳性。

2 结果

400例HBsAg ELISA法阴性标本经荧光定量PCR检测有5例HBV?DNA阳性，阳性率为1.25%，拷贝数分别为：2.8×104/ml， 3.71×104/ml，4.12×105/ml，4.83×104/ml，8.14×103/ml。

3 讨论

卫生部下发的《血站管理办法(暂行)》中规定，对献血者血液HBV检测的质量标准是HBsAg ELISA阴性，但HBsAg并不代表病毒本身，只有HBV?DNA的存在才是HBV感染最为直接、最为灵敏、最为特异的指标，随着PCR检测技术的日趋成熟，方法的不断更新，灵敏度、准确度大幅提高且广泛应用，HBsAg ELISA法阴性而HBV?DNA阳性的病例报道也越来越多：96年沈迎枫报道20例HBsAg和抗?HBc ELISA法均阴性的血标本中有5例HBV?DNA阳性［1］；98年邱惠娟等报道233例HBsAg阴性血样本中有4例HBV?DNA阳性［2］；98年何英等报道234例HBsAg阴性血样本中33例HBV?DNA阳性［3］；2002年德国的Hennig教授采用荧光定量PCR检测了189份HBsAg阴性但抗?HBc阳性的献血者标本中有3份HBV?DNA阳性［4］；本实验也进一步证实HBsAg阴性并不一定表示没有HBV感染，只是所用的免疫学方法检测不出来而已，原因可能有以下几点。

3.1 HBV基因变异 HBV的S基因负责编码表达HBsAg，任何影响S蛋白表达水平或抗原性的突变都可能导致HBsAg检测出阴性结果。Koyanagi［5］等对1例HBsAg检测为阴性的HBV感染者的病毒S基因进行测序发现“a”决定簇中的129位和145位均出现突变：129位是由谷氨酰胺突变为天冬酰胺，145位由甘氨酸突变为丙氨酸，这种突变改变了HBsAg与多克隆抗?HBs的结合识别能力，从而使标准的检测试剂盒测不出来。Weinberger［6］等报道了1例删除突变，31位的碱基被删除导致框移突变，使得21位的氨基酸后出现一个终止密码子，HBsAg没有表达。

3.2 HBV的整合 HBV?DNA序列可以整合到人细胞染色体DNA中，整合后的HBV?DNA可能发生序列重排，这将改变HBsAg的表达，从而导致血清HBsAg检测为阴性。

3.3 试剂盒的灵敏度太低 目前HBsAg的检测主要采用ELISA方法，不同厂家乃致同一厂家不同批号试剂盒测定下限都可能会有差异，国产试剂盒的测定下限在0.5 ng/ml左右，进口试剂盒为0.2 ng/ml，而PCR采用的是将样本中的核酸先扩增上百万倍后再进行检测，具有极高的灵敏度，这样使得有些标本虽然HBsAg为阴性，但仍然可以检测出HBV?DNA。

3.4 Hook效应导致假阴性 在一步法ELISA检测HBsAg实验中当HBsAg浓度非常高时，所加入的酶标记抗?HBs主要与游离的HBsAg结合，随后被洗涤掉导致结果阴性。单桂秋等对844份血清分别用一步法和二步法同时检测HBsAg发现由于Hook现象导致HBsAg漏检率高达0.95%［7］。虽然现在厂家通过提高单克隆抗体的亲和力削弱Hook，但对血站来说，为了血液安全建议还是采用二步法为好。在HBV感染初期，也可能是有HBV?DNA而无HBsAg。总之，由于病毒与宿主两方面的原因，HBV对人体的感染表现很复杂，药物的滥用，使病毒更易产生变异，而单纯以HBsAg来判断有无HBV感染容易造成漏检，特别是在对献血者的HBV筛查时，这种漏检会造成受血者感染HBV，因而有必要用更灵敏的PCR检测替代原有的ELISA法来进行献血者的筛查。可喜的是，我国已有血站开始采用PCR筛查献血标本。荧光定量PCR技术是将荧光标记技术与PCR技术相结合，从而实现核酸定量检测出模板DNA的拷贝数，而且不需PCR后处理，整个过程仅有加入样品的一次开盖，其余时间完全闭管操作，克服了常规PCR技术易污染、假阳性率高等难题，灵敏度极高，将其应用于献血者的HBV筛查，可有效地减少HBV的漏检，显著提高血液质量，降低经输血传播HBV的可能性。

参考文献：

［1］ 沈迎枫. 聚合酶链反应检测献血者乙肝病毒基因［J］. 临床检验杂志,1996，14(3):140.

［2］ 邱惠娟, 徐兰娣, 陈婷.HBV血清学标志与PCR检测结果的关系［J］. 上海医学检验杂志,1998，13(3):143.

［3］ 何英,卢道英.PCR方法检测HBV?DNA与ELISA检测HBV?M的对比分析［J］. 上海医学检验杂志,1998，13(3):147.

［4］ hennigh,Puchta I,Luhm J,et al. Frequency and load ofhepatitis B virus DNA in first?time blood donors with antibodies tohepatitis B core antigen［J］. Blood,2002，100(7):2637.

［5］ Koyangagi T ,Nakamuta M ,Sakaih,et al .Analysis ofhBs antigen negative variant ofhepatitis B virus : uniqe substitutions, Glu129 to Asp and Gly145 to Ala in the surface antigen gene［J］. Med Sci Monit, 2000，6(6):1165.

［6］ Weinberger KM ,Zoulek G,Bauer T,et al. A novel deletion mutant of hepatitis Bvirus surface antigen［J］. J Med Virol, 1999，58(2):105.

［7］ 单桂秋,李秋生,肖韶英. 检测乙型肝炎表面抗原的一步法试剂的勾状效应分析［J］. 中华检验医学杂志, 2000，25(2):107?108.