HBsAg\HBcAg的免疫荧光检测在HBV-GN诊断中的应用

[摘要] 目的 观察乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)患者肾脏组织中HBsAg、HBcAg的表达情况。方法 以50例HBV-GN患者为研究对象,另随机选择20例非乙型肝炎病毒相关性肾炎(NHBV-GN)患者作为对照组,用间接免疫荧光法检测肾穿刺活检组织HBsAg、HBcAg的表达。结果 HBV-GN患者肾组织中可检测HBsAg、HBcAg阳性颗粒,阳性率分别70%(35/50),24%(12/50);20例(NHBV-GN)患者肾脏组织HBsAg、HBcAg均未检出。与HBV-GN差异有统计学意义(P

[关键词] HBsAg;HBcAg;乙型肝炎病毒相关性肾炎;肾脏;免疫荧光

[中图分类号] R446.8[文献标识码] A [文章编号] 1673-9701(2010)04-12-03

Application of HBsAg and HBcAg Immune Fluorescence Detection in Diagnosis of Hepatitis B Virus Associated Glomerulonephritis

CHEN Yupeng1CHEN Hong1WANG Xingfu1ZHANG Sheng1PENG Weihua2ZHENG Ke1

1.Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou 350005,China; 2.Department of Nephrology,Fuzhou General Hospital of Nanjing Military Region,Fuzhou 350025,China

[Abstract] Objective To observe the HBsAg and HBcAg expression in the renal tissue in hepatitis B virus associated glomerulonephritis(HBV-GN). Methods We selected 50 cases of HBV-GN as research group and the other randomly selected 20 cases of non-HBV-GN(NHBV-GN)as control group and used indirect immunofluorescence assay to detect the HBsAg and HBcAg expression in the renal puncture biopsies. Results The HBsAg and HBcAg-positive particles in the HBV-GN renal tissue could be detected,with the positive rates of 70%(35/50)and 24%(12/50),while HBsAg and HBcAg failed to be detected in the kidney tissue of 20 cases of NHBV-GN,with a significant difference between the two groups(P

[Key words] HBsAg;HBcAg;Hepatitis B virus related glomerulonephritis;Renal tissue;Immunofluorescence

乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)是指乙型肝炎病毒感染人体后,病毒抗原HBsAg、HBcAg、HBeAg与体内相应抗体形成免疫复合物沉积在肾组织中,引起免疫复合物性肾小球肾炎[1,2]。本次研究以50例HBV-GN患者为研究对象,另随机选择20例非乙型肝炎病毒相关性肾炎(NHBV-GN)患者(剔除狼疮性肾炎等引起HBsAg、HBcAg非特异性沉积的肾炎)作为对照组,用间接免疫荧光法检测肾穿刺活检组织HBsAg、HBcAg的表达,以探讨HBsAg、HBcAg的免疫荧光检测在乙型肝炎病毒相关性肾炎诊断中的应用。

1材料与方法

1.1材料

收集2008年5月～2009年5月福州总医院肾内科收治患者50例,所有病例均经HBV血清学检测证实存在HBV感染,并在B超引导下行经皮肾穿刺活检术,肾组织分别进行组织学、免疫荧光及超微病理检查。20例非乙型肝炎病毒相关性肾炎(NHBV-GN)患者作为对照组,为福建医科大学附属第一医院肾脏穿刺活检组织。

1.2试剂

①鼠抗人HBsAg(1∶50),山羊抗鼠IgG/FITC(1:75);兔抗人HBcAg(1∶50),山羊抗兔IgG/FITC(1∶75),购自DAKO公司。②Polyclonal Rabbit Albumin/FITC(1∶50)购自DAKO公司。③0.01mol/L(pH 7.2～7.4)PBS。④抗体稀释液(S3022 DAKO公司)。⑤缓冲甘油:1份0.1mol/L(pH 8.0)PBS与9份甘油混匀。

1.3仪器

Leica CM3050冷冻切片机,Olympus BX61荧光显微镜+DP70数码摄像机。

1.4方法[3]

①肾组织冷冻切片在室温下稍风干后,在室温下用冷丙酮固定10min。②PBS冲洗2×3min。③分别滴加鼠抗人HBsAg、兔抗人HBcAg,室温孵育30min。设立Albumin作对照排除。④PBS冲洗2×3min。⑤分别滴加山羊抗鼠IgG/FITC、山羊抗兔IgG/FITC,室温避光孵育30min。⑥PBS冲洗2×3min。⑦缓冲甘油封片,荧光显微镜下观察结果。

1.5统计学处理

数据采用SPSS11.5软件包进行χ2检验分析,P

2结果

HBV-GN患者肾组织中可检测HBsAg、HBcAg阳性颗粒,阳性率分别70%(35/50),24%(12/50);20例(NHBV-GN)患者肾脏组织HBsAg、HBcAg均未检出。与HBV-GN相比差异有统计学意义(P

3讨论

乙型肝炎病毒感染在我国高发,由其所引发的乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)较常见[4],HBV-GN是HBV感染后主要的肝外脏器病变[5]。HBV-GN的发病机制目前尚不十分清楚,据文献报道其发病机制[6]为:①免疫复合物介导的炎症反应是目前公认的发病机制之一;②系膜区及内皮下的循环免疫复合物的沉积;③上皮下原位免疫复合物形成;④HBV感染肾组织后原位表达抗原;⑤自身的免疫反应;⑥细胞免疫缺陷;⑦遗传因素;⑧生物社会学因素。目前HBV-GN在国际上尚无诊断标准,国内学者参考中华医学会儿科学分会肾脏病学组提出以下诊断条件[7]:①血清HBV标志物阳性;②患肾小球肾炎,并可除外狼疮性肾炎等继发性肾小球疾病;③肾组织中找到HBV抗原或HBV-DNA;④肾组织病理为膜性肾病。符合①②③条即可确诊,无论其肾组织病理类型如何,若符合第①②④条时,尽管其肾组织中未查到HBV抗原或HBV-DNA,可作为拟诊。其中第③条是确诊HBV-GN的必备条件。肾组织内检测到HBV-DNA提示HBV的直接感染[8]。Wang等[9]研究表明,HBV不仅通过形成免疫复合物导致肾损害,也可直接感染肾组织参与肾病进展。在HBV-GN的肾小球内皮细胞、系膜细胞和肾小管上皮细胞中均能检测出游离型和(或)整合型的HBV-DNA[10],并发现HBsAg阳性颗粒的分布与HBV-DNA基本一致[11]。

HBsAg、HBcAg的免疫荧光检测采用间接法检测,此法是直接法的重要改进,先用特异性抗体与肾组织结合,形成抗原-抗体复合物,再用针对一抗的标记荧光素的二抗与上述抗原-抗体复合物结合,形成抗原-抗体-荧光抗体的复合物,发出荧光,在荧光显微镜下观察。间接法较直接法敏感5～10倍,而且只需要一种标记的荧光抗体[12]。此法的缺点是:容易引起非特异性染色。实验过程中采用NHBV-GN患者(选择肯定无HBsAg、HbcAg沉积的病例)作为对照组,同时应用Polyclonal Rabbit Albumin/FITC作对照排除。以保证结果的正确判读。

本次研究结果显示,HBV-GN患者肾组织中可检测到HBsAg、HBcAg阳性颗粒,阳性率分别70%(35/50),24%(12/50);20例(NHBV-GN)患者肾脏组织HBsAg、HBcAg均未检出。与HBV-GN相比差异有统计学意义(P

HBsAg、HBcAg免疫荧光标记是诊断HBV-GN的重要指标。HBsAg和HBcAg与HBV-GN的关系较大。HBsAg是HBV-MN和HBV-MPGN的主要抗原,HBV-MsPGN及HBV-IgAN的致病抗原是HBsAg和HBcAg。现检测HBV 抗原主要依靠免疫组化及间接免疫荧光法,本次研究采用间接免疫荧光法,这是目前应用较广的免疫荧光技术[14],除灵敏度高外,它只需要制备一种种属间接荧光抗体,可以适用于多种第一抗体的标记显示,同时可提高各种HBV-GN的检出率,为国际上公认的肾活检病理诊断和研究的重要染色手段,值得推广应用。

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(收稿日期:2009-08-13)