荧光定量检测HBV-DNA临床分析

【中图分类号】R450 【文献标识码】A 【文章编号】1005-2720(2010)01 - 025 - 01

【摘要】目的 了解乙肝患者HBV DNA含量及HBV DNA阳性患者用药前后的疗效观察。方法 应用荧光PCR扩增病毒核酸免疫技术定量检测6018例血清标本的HBV DNA含量。结果 荧光定量PCR的特点与定性PCR主要区别在于荧光PCR即时反映扩增过程,采用内标法全封闭减少污染,高灵敏的自动化仪器对荧光的收集和分析能达到对原始模板量定量检测。结论 用此方法可较准确及时地为临床提供科学的诊断依据,并对HBV DNA阳性病人用药前后提供可靠数据。

血清HBV标志物的检测给临床诊断乙肝病毒感染提供了较为便捷的诊断依据,在临床应用过程中发现由于病情的发展过程的结局的多样性,尤其是肝功转氨酶正常而体内确实有病毒复制者的治疗中,定量PCR检测HBV- DNA为HBV感染及其疗效的判定提供了一项重要指标,我院引进荧光定量PCR检测技术,共检测乙肝病毒感染者及疑是感染者的HBV- DNA含量6018例,现总结分析,报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Bio-Rad iCycler多荧光频道可用于乙肝病毒DNA检测。

1.1.2 试剂盒 由深圳匹基公司引进美国技术研制生产。

1.1.3 资料 收集我院2008年3月至2009年5月门诊及住院患者的血清,取清晨空腹静脉血 3 mL 送检。

1.2 方法

1.2.1 原理 PCR是聚合酶链式反应,是一种体外内引物介导的特定DNA序列的酶促合成反应,1985年由美国Cotus公司Mullis等提出。

1.2.2 荧光定量PCR特点 与定性PCR的主要区别:定量PCR采用终点定量(end point PCR),在PCR循环结束后对PCR扩增产物进行检测定量化,最大范围为4个数量级;对数期定量(log phase PCR)是在PCR的对数增长期对PCR扩增产物进行检测定量化,最大定量范围可达到10个数量级;荧光PCR利用荧光染料在光刺激下释放的荧光能量的变化又直接反映出扩增产物量的变化,荧光信号变量与扩增产物变量成正比。并通过足够灵敏的自动化仪器,实现对荧光的采集和分析以达到对原始模板定量检测的目的。我院就是应用荧光定量PCR技术开展对乙肝病人及疑是HBV-DNA感染者进行检测。

1.3统计学处理 计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示 ,多组间比较采用 F 检验,两两比较采用 q 检验。计数资料比较采用X2 检验。以 P

2 结 果

我院共检测住院及门诊病人血清6018人次,统计分析结果见表1。

注:A:HBsAg(+),HBeAg(+),HBcAb(+)C:HBsAg(+),HBcAb(+)

B:HBsAg(+),HBeAb(+),HBcAb(+)

3 讨 论

根据资料报道,我国有1.6亿慢性HBsAg携带者[1],合理而适当的处理这些人群的问题不仅是医学问题而且是重要的社会问题。我国的感染率约为10%,而受 HBV 慢性感染的人群患原发性肝癌的相对危险性至少增加 300 倍。对 HBV 感染的防治仍是我国健康与传染病控制中的首要问题 。其中一部分患者有可能发展为肝硬化甚至肝癌。处于亚健康状态的人得到合适的处理。当肝功能正常,但HBV-DNA阳性,B超无异常的可早期治疗,需每年追踪观察,个体治疗疗效观察做HBV DNA定量显得尤其重要[2]。定期观察HBV量的变化,可作为抗病毒药物疗效观察指标,可直接反映病原体滴度是否受药物影响发生变化,了解病毒在体内的复制及传染性,并对临床HBV感染的诊断、治疗方案的选择及疗效判定有很好的指导作用[3]。

用免疫荧光核酸定量分析,因其方法有极高的灵敏性和特异性[4],能准确测定出HBV-DNA拷贝值(1个拷贝链约为150对碱基)。根据HBV DNA含量的高低,加上肝功能可判断其是否有病毒复制,是否需抗病毒治疗,特别对早期发现HBV感染的窗口期治疗更有意义。HBV-DNA定量检测能准确反映病毒复制情况,是HBV治疗唯一有效的直接疗效监测指标[5],是动态观察药物疗效的确切指标。只有掌握患者体内 HBV 复制情况,才能做出正确的临床诊断和选择更合理的治疗方案来进行治疗。

本试验应用荧光PCR内标法,采用两个不同波长的荧光探针,分别与病原体模板DNA及内标结合,并在PCR过程中释放两个不同波长的荧光信号,通过两个荧光信号的关系反映出真实病原体DNA含量。全封闭反应减少污染,无需PCR后处理,特异性强,灵敏度高;采用对数期分析摒弃终点数据,定量准确。操作时间短,其敏感性也高于斑点杂交。

【参考文献】

[1] 计一平,等.病毒性肝炎免疫治疗进展.临床肝胆病杂志,2001,17(1):7-8.

[2] Abe A,Inoue K,Tanaka T,et al. Quantitation of hepatitis B virus genomic DNA by real-time PCR[J].J Clin Microbiol,1999,37(9):2899-2903.

[3] 吴婷,等.慢性肝病患者血清HBV DNA定量检测及临床应用.中国医师杂志,2001,2(4)264-265.

[4] 李庆科,等.探讨HBV-DNA荧光定量分析在HBV感染诊疗中的合理应用.现代检验医学杂志,2005,20(6):54-55.

[5] 李金明.乙型肝炎病毒血清标志物测定及结果解释的若干问题[J].中华检验医学杂志,2006 ,29(5):385-389.