牛流行热病毒山东地方株的分离与鉴定

摘要：利用BHK-21细胞，接种山东济南地区疑似牛流行热病牛高热期的抗凝血，经盲传3代，分离到1株病毒，经RT-PCR鉴定为牛流行热病毒，命名为BEFV-SD。理化特性试验表明：BEFV-SD对热敏感，56℃ 10 min、37℃18 h可被灭活，对乙醚、氯仿等敏感；BEFV-SD可被BEFV阳性血清中和，中和效价为1∶408；将BEFV-SD的G基因与GenBank中公布的BEFV进行同源性比较，同源性达到96.3%以上。

关键词：牛流行热病毒；分离；鉴定；同源性

中图分类号：S855.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0031-04

牛流行热 （Bovine Ephemeral Fever，BEF）是由牛流行热病毒（Bovine Ephemeral Fever Virus，BEFV）引起的牛和水牛的一种急性、热性传染病，其特征是突发高热、呼吸迫促、消化机能障碍、全身虚弱、僵硬、跛行[1]。首先发现于19世纪中期的东非，随后流行于非洲、亚洲和大洋洲许多国家和地区[2～5]。本病流行具有明显的季节性，多发生于雨量多和气候炎热的7～10月。该病传播迅速，流行面广，有一定的周期性[6]，曾在我国多个省份多次发生，导致奶牛产奶量降低，乳品质下降，役用牛跛行或瘫痪，部分怀孕母牛流产，给养牛业造成重大经济损失。本实验室采集了疑似患牛流行热病牛高热期的抗凝血，进行了病原分离，经各项试验鉴定，证实分离获得了牛流行热病毒。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1病料来源采集山东省济南市周边出现急性发热、呼吸道和消化道机能障碍的奶牛高热期的静脉血，肝素钠抗凝，-20℃保存。

1.1.2实验材料100 mm培养皿、96孔培养板为Costar产品，DMEM营养液、胎牛血清购自Giboco公司，RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、DL2000 DNA Marker等分子生物学试剂购自大连宝生物工程公司，琼脂糖、溴化乙腚等试剂购自上海生工生物技术有限公司，BHK-21细胞为山东省农科院奶牛研究中心实验室保存。

1.1.3引物设计与合成根据牛流行热病毒主要免疫保护性糖蛋白G（BEFV-G）的保守核苷酸序列 （GenBank登录号为AF234533.1） 设计引物BEFJ1（5′-AGAGCTTGGTGTGAATAC-3′）和BEFJ2（5′-CCAACCTACAACAGCAGATA-3′），扩增片段大小为420 bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2方法

1.2.1病毒的分离与传代将临床疑似牛流行热的病牛抗凝血反复冻融3次后，4℃离心（4 000 r/min）5 min后取上清，接种于长满单层的BHK-21细胞，37℃吸附1 h，加入含有2%胎牛血清的DMEM细胞维持液，连续3 d观察是否出现细胞病变（CPE），若未发生CPE盲传3代，仍未出现CPE且RT-PCR鉴定为阴性者废弃，阳性者继续传代，直至出现CPE，当出现80%CPE时收毒，冻融3次后，继续传代3次。经无菌检验合格后，小管分装，-70℃冻存备用。并按方法1.2.2进行病毒的RT-PCR鉴定。

1.2.2RT-PCR检测病牛的抗凝血及培养病毒液反复冻融3次后，用病毒RNA提取试剂盒提取RNA，反转录cDNA， 进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×buffer 2.5 μl，25 mmol/L MgCl2 1.8 μl，10 mmol/L dNTPs 0.5 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各0.7 μl，模板DNA 1.5 μl， Taq DNA 聚合酶（5 U/μl）0.4 μl，加三蒸水至25 μl。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30s，56℃复性30 s，72℃延伸30 s，35个循环；最后72℃延伸3 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3病毒理化特性试验对分离毒种的第6代BHK-21细胞培养物进行理化特性鉴定，用终浓度50 mg/L的5-碘脱氧尿核苷处理分离毒种，鉴定病毒的核酸型；用乙醚、氯仿处理分离毒种，进行脂溶性敏感试验；用pH 3.0的盐酸处理分离毒株进行耐酸性试验；56℃水浴10～30 min，37℃孵育12～36 h，对分离毒株进行耐热性试验，同时分别设立对照组。

1.2.4中和试验采用固定病毒稀释血清的方法，将200 TCID50/100μl分离株病毒液与等量的不同倍比稀释度的BEFV阳性血清充分混合， 37℃感作1 h，将每个混合液接种于弃去生长液的长满单层BHK-21细胞的96孔细胞培养板中，37℃吸附1 h后，每孔加细胞维持液 100 μl，置于37℃、5% CO2 培养箱静置培养7 d，逐日观察CPE 情况并记录。同时设立血清毒性对照、阴性血清对照和空白试验对照。

1.2.5分离病毒株的G蛋白编码区的克隆测序及其同源性比较对分离病毒株进行RNA提取，然后进行G蛋白编码区的RT-PCR扩增，扩增片段为1 872 bp，纯化PCR产物，克隆到T3载体，送上海生工测序，对获得分离株的G蛋白序列进行同源性比较和进化树分析。

2结果与分析

2.1分离病毒可见致细胞病变效应

将临床疑似牛流行热的病牛抗凝血接种长满80%的单层BHK-21细胞，盲传3代后，出现细胞病变，特征为细胞开始变圆，胞质内颗粒增多，融合成小集落（见图1B），然后细胞全部变圆（图1C），脱落死亡。将获得的病毒进行继代培养，传至3代后，细胞病变规律、典型，将此分离毒株命名为BEFV-SD。