胡萝卜人工种子制备技术

摘要 总结了胡萝卜人工种子制备技术，包括胡萝卜人工种子胚状体的诱导、人工种子的成熟与干燥、人工种子的包埋方法、人工种子的贮藏和萌发以及人工种子的应用前景，以供参考。

关键词 胡萝卜；人工种子；制备技术

中图分类号 S631.203+.8 文献标识码 B 文章编号 1007-5739（2016）13-0119-01

人工种子是当前体细胞胚胎学及遗传学研究中的一个重要课题。人工种子又称合成种子，一般是指离体培养条件下的植物材料，通过繁殖获得大量高质量的成熟胚状体，把这些胚状体外面包上有机化合物作为保护胚状体及提供营养的“种皮”，从而创造出与真种子类似的结构。因此，人工种子包括体细胞胚、人工乳胚和人工种皮3个部分。最外面一层为有机薄膜包裹，保护水分免于丧失和防止外部物理力量的冲击；中间含有胚状体所需要的营养成分和某些植物生长调节剂；最里面是胚状体或芽。

1 人工种子胚状体的诱导

将胡萝卜天然种子表面消毒，在无菌条件下发芽成无菌苗；切割下胚轴或子叶接种在含2，4-D 0.5～1.5 mg/L的MS培养基上诱导胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织悬浮在MSo培养基中，诱导产生体细胞胚；每7～10 d更换1次培养液，振荡培养；扩大繁殖量或继代培养。

2 人工种子的成熟与干燥

繁殖体必须同步增殖并达到成熟方可用人工种子的制备。体细胞胚诱导成功后，必须转入成熟培养基，胡萝卜的体细胞胚的成熟培养基有以下3个步骤。

2.1 愈伤组织的诱导和保存

愈伤组织诱导所用的外植体可为无菌苗的下胚轴（长0.5 cm）或消毒叶柄（长0.5～1.0 cm）、贮藏（横切面0.5 cm2）。愈伤组织诱导培养基为MS+2.4-D 0.1～1.0 mg/L，蔗糖30 g/L，琼脂8g/L。在温度26℃、黑暗条件下培养4～8周，即可获得愈伤组织。愈伤组织可转到相同成分的悬浮培养基上进行继代培养，每50 mL液体培养基中加2.5～3.0 g愈伤组织，摇床转速为80～160 r/min，每隔14～18 d继代培养1次，光照1 000 lx，也可在固体培养基上进行继代培养。

2.2 体细胞胚的诱导

继代4次以上的愈伤组织，用不锈钢的32、63、125 μm的过滤筛过滤。将保留在32 μm的细胞团在1 000 r/min下离心5次后，沉淀物用于体细胞胚诱导。体细胞胚胎诱导培养基是不含2，4-D的培养液，其余成分与愈伤组织诱导培养基相同。每10～18 d将上述悬浮培养物移入1/2MS固体培养基上使体细胞胚成苗。

2.3 体细胞发生的主要阶段

胡萝卜的胚性培养物是在无激素的培养基中形成的，而单细胞不能在无激素的培养基上直接分化形成胚状体。因此认为体细胞胚胎发生至少经历2个阶段，即需要生长素阶段和不需要生长素阶段。在球形胚出现之前，先形成胚性细胞团，它们是在含有生长素的培养基上形成的（0期）；胚性细胞团转到无激素的培养基上进行体细胞胚诱导，细胞缓慢增殖（1期）；胚胎发生细胞团某部分细胞在体胚生长发育培养基上迅速分裂，形成球形胚（2期）；球形胚在成苗培养基上经历心形胚和鱼雷形胚发育形成再生植株（3期）。加入ABA，有助于营养成分积累，胚中的脂肪、淀粉及蛋白质含量增加，与合子胚发育情况类似，如在培养基中加入8～12 μmol/L ABA，可显著提高针叶数胚状体的成熟。加入PEG，使胚中水分减少，不会发生质壁分离，类似天然种子成熟过程的自然脱水现象，提高人工种子抗逆能力。

研究发现，经过干燥的繁殖体，其人工种子的成株率可明显提高，但在另一些植物中有降低的趋势。如苜蓿体细胞胚含水量降低到8%～15%，在室温条件下贮存12个月仍有发芽能力。特别是用ABA处理后，成株率为70%，而不加ABA则成株率为0。目前，已有10余种作物进行了人工种子干燥处理的研究，其中有胡萝卜、芹菜、大豆、油菜、苜蓿、小麦、葡萄等，其繁殖体大多为体细胞胚。

3 人工种子的包埋方法

根据繁殖体的不同特点，人工种子胚乳中可以附加多种成分，使其获得优异的性能，如加入大量元素营养成分可促进种子萌发生长。在缺少某种微量元素的土壤中，可针对性地加入该元素。添加微量的农药可抵御播种时病虫害对人工种子的侵袭。胡萝卜常见的人工种子的包埋方法有3种：一是离子交换法。采用水凝胶法，即用吸管将一个胚状体吸到吸管尖端膨大部位，在此膨大部位盛有海藻酸钠或褐藻酸钠凝胶，再把它们一起挤入CaCl2或Ca（NO3）2溶液中进行络合。褐藻酸钠的浓度为0.5%～5.0%（w/v），络合剂的浓度为30～100 mmol/mL，络合时间以30 min为佳。二是干燥法。用2.5%聚氧乙烯作为包裹介质，然后使其干燥固化。三是冷却法。用0.25% Gelritr胶包埋，冷却固化[1-2]。

4 人工种子的贮藏和萌发

人工种子可浸入石蜡中或装入铝箔保存。铝箔袋贮藏运输和销售方便，但贮存时间短。用Polyox干燥固化制作的胡萝卜人工种子，在4 ℃黑暗下可存活16 d，用低温及脱落酸处理，存活率可从4%提高到20%，最高可达58%。在研究海藻酸钙包裹胡萝卜体细胞胚制作的人工种子时，低温与干燥在一定程度上抑制萌发，失水率67%的人工种子在2 ℃下贮存2个月发芽率仍达100%，成苗率达76%。胡萝卜人

工种子在无菌条件下，经过一定的处理，有较高的萌发率和再生率（60%～90%）。目前多数人工种子萌发率较低，而在正常的土壤条件下萌发成苗率就更低。人工种子萌发的幼苗中弱苗和畸形苗较多，其主要原因是人工种子的质量问题，包括体细胞胚的发育和完熟程度、遗传变异影响等。研究表明，在培养基中加入脱落酸，可明显提高胚状体的质量，增加成株率。用不良环境压力法如氯酸钠刺激法、高浓度糖法诱导胡萝卜人工种子，可提高其发育成苗的能力[3-4]。

5 人工种子的应用前景

大量繁殖体细胞胚并制成人工种子，为植物的无性繁殖开辟了一条崭新的途径。其应用前景决定于它的经济效益。虽然胡萝卜的经济价值不高，但它是体细胞胚胎发生的模式植物，利用它进行人工种子的研究可为其他蔬菜，如大蒜、黄瓜、番茄、马铃薯等人工种子的研究开发奠定了基础。

6 参考文献

[1] 李爱贞，刘毅君，陈艳红.胡萝卜人工种子包衣材料的筛选[J].亚热带植物科学，2010（2）：17-20.

[2] 李玮，于惠敏，李秀荣，等.植物人工种子的研究现状及应用前景[J].科技信息，2010（26）：772-773.

[3] 胡自华，李宝健.胡萝卜人工种子制备的初步研究[J].中山大学学报论丛，1989（4）：91-98.

[4] 丁绍欢，张明生，史梦娜.植物人工种子技术研究进展[J].种子，2011（3）：60-66.