宝坻大蒜愈伤组织诱导及植株再生体系优化

摘 要：以宝坻大蒜发芽叶为外植体，比较了不同培养基的诱导效率，优化了愈伤组织诱导及植株再生体系。试验结果表明，诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+2，4-D 2.0 mg·L-1 +NAA 2.0 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1；诱导不定芽的最佳培养基为MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+KT 1.5 mg·L-1；诱导生根的最佳培养基为MS+NAA 0.6 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1。

关键词：宝坻大蒜；发芽叶；愈伤组织；快繁

中图分类号：Q945.41 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.03.003

大蒜是百合科葱属2年生草本植物，有很强的食用和医疗保健价值。大蒜种质资源丰富、优良品种众多。但由于采用无性繁殖， 繁殖系数低，病毒易积累和传播，造成品种退化甚至濒临灭绝，且不能进行杂交育种， 使其遗传学和生物学多样性得不到充分利用。因此，进行种质资源创新和新品种培育具有重要意义 。目前已在系统选育[1]、理化诱变[2-3]、有性生殖[4]等方面开展了研究。

大蒜脱毒快繁技术能有效地防止大蒜品种退化，保持优良种性，提高繁殖系数，已建立了较为完善的脱毒培养方法体系[5-7]，但有关宝坻大蒜的脱毒快繁技术研究报道较少，主要以花梗[8]、发芽叶[9]为外植体进行组织培养。宝坻大蒜‘六瓣红’是津沽名优特产之一，是全国大蒜营养价值最高的品种。本研究利用组织培养快繁技术，以宝坻大蒜发芽叶为外植体进行愈伤组织诱导及植株再生，优化了快繁培养基体系，提高了愈伤组织诱导率，为宝坻大蒜的脱毒快繁和种质创新打下基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

宝坻大蒜‘六瓣红’。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基的配置 以MS培养基为基本培养基，添加不同种类和浓度的激素，pH值为5.8；高温高压灭菌20 min；待冷却至60 ℃时，分装到200 mL的组培瓶中，每瓶约40 mL，封口备用。

1.2.2 外植体的消毒 选取生长健壮、无病虫害的大蒜蒜头，剥去外面鳞叶，挑取个大、饱满、无病斑的新鲜蒜瓣，清水中培养24 h，用流动的自来水冲洗20 min左右，用蒸馏水冲洗1遍，0.1%的升汞消毒10 min，再将其在75%浓度酒精中浸泡5 min，用双蒸水洗3次，备用。

1.2.3 接种及愈伤组织诱导 接种前，紫外线消毒30 min。切取大蒜发芽叶，接种到培养基上，置于人工气候箱中培养。每瓶接种5个发芽叶，每个处理10瓶，共设21个处理。培养条件为日温25 ℃，夜温20 ℃，光强1 500 lx，光照时间14 h·d-1，培养4周后进行观察统计。

1.2.4 愈伤组织的增殖及不定芽的分化 待出现愈伤组织后，每隔20～25 d继代1次，选取继代2次的愈伤组织转入诱导不定芽分化的MS培养基中，每瓶接种4块愈伤组织，每个处理5瓶，共设9个处理。4周以后观察分化生长情况，并统计不定芽分化数。

1.2.5 生根培养 将分化出不定芽后的绿苗转入生根培养基，诱导生根，生根培养基共设8个处理，2～3周后统计生根条数。

2 结果与分析

2.1 大蒜发芽叶愈伤组织类型

大蒜发芽叶接种28 d左右可以诱导出愈伤组织，愈伤组织大致有以下4种类型：白色雪花状、质地松散的愈伤组织（图1-a）；半透明、呈浆糊状的光滑型愈伤组织（图1-b）；呈浅黄色瘤状突起，质地较致密的愈伤组织（图1-c）；红褐色、较致密的愈伤组织（图1-d）。

本试验中，前3种类型的愈伤组织在继代培养过程中，出愈率较高，容易成活，而第4种红褐色致密愈伤组织不发生分化，保持原状或褐化死亡。

2.2 不同激素配比对诱导大蒜发芽叶愈伤组织的影响

2，4-D是人工合成的植物激素，调节植物生长，利于愈伤组织的诱导，但不利于愈伤组织的增殖和分化。由表1可以看出，处理1～9中，2，4-D的浓度较低，形成愈伤组织缓慢且出愈率较低；处理12的出愈率最高，达到98%，当2，4-D的浓度为3.0 mg·L-1时 （16～21号培养基），愈伤组织形成个数稍有降低，愈伤组织结构松散易碎。

NAA和KT作为细胞分裂素，在大蒜发芽叶愈伤组织形成过程中也起着重要的作用，其不同的浓度配比对愈伤组织诱导具有一定的影响。当培养基中NAA浓度为2.0 mg·L-1，KT的浓度为1.0 mg·L-1时愈伤组织发生效果较好。何俊英等[9]以发芽叶为外植体，用2 mg·L-1 2，4-D和0.5 mg·L-1 KT诱导愈伤组织，出愈率30%左右；利用贮藏叶+发芽叶诱导愈伤组织，出愈率90%左右。本研究调整了愈伤组织诱导的激素配比，出愈率达到98%。因此，诱导大蒜发芽叶愈伤组织的最佳培养基为MS+2，4-D 2.0 mg·L-1+NAA 2.0 mg·L-1+KT 1.0 mg·L-1。

2.3 不同激素配比对发芽叶愈伤组织不定芽分化的影响

从表2可以看出，将继代两次生长旺盛的致密愈伤组织转入不同激素配比的分化培养基中，每隔1周观察1次。愈伤组织诱导芽分化时有以下几种情况：愈伤组织先分化出白色气生根，再分化出不定芽（图2-a）；愈伤组织块儿上黄色的瘤状突起从表面变绿，接着绿色的愈伤组织慢慢长出丛生状小芽，再从基部或侧面分化出短而粗的根，最后小芽伸展长成幼叶（图2-b）；根与不定芽同时发生（图2-c）；只分化出根，无不定芽分化（图2-d）；极少数有玻璃化苗出现（图2-e），而且叶细长畸形，这可能是由于6-BA浓度过高而抑制不定芽分化形成的。

由表2还可以看出，植物激素浓度和种类对愈伤组织的分化生芽能力的影响是不同的。处理1、2、3中6-BA、NAA、KT浓度较低，芽的分化也最低，分化出的不定芽细弱；处理9中，生芽少，苗的玻璃化较严重，形成细丝状根；处理4、5、6产生的芽健壮，而且生根较少；处理6不定芽平均个数最多，为6个。因此，诱导生芽的最佳培养基为MS+6-BA 1.5 mg·L-1+NAA 1.0 mg·L-1+KT 1.5 mg·L-1。

2.4 不同激素配比对试管苗生根的影响

从表3可以看出，当培养基中NAA的浓度为0.6 mg·L-1，KT浓度0.5 mg·L-1时，不定芽最早生根，生根数最多，平均生根条数为8.04，而且芽较长、较粗，纯白色。当KT浓度一定时，较高和较低浓度的NAA均会抑制生根，表现为根少、纤细。可见，NAA在诱导生根时起主导作用，KT有利于根的横向生长，诱导出健壮的根。因此，诱导生根的最佳培养基为MS+NAA 0.6 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1。

3 讨 论

在离体条件下，植物激素对大蒜发芽叶愈伤组织的诱导、增殖、不定芽的分化和试管苗的生根起着重要作用。其中2，4-D在发芽叶愈伤组织的诱导中起决定性作用，较高浓度的2，4-D有利于愈伤组织的诱导，并且能够诱导出结构致密的愈伤组织。2，4-D 浓度过低或过高，愈伤组织出愈率均会下降。何俊英等[9]认为，2，4-D浓度过低不能引起细胞脱分化，是由于进入细胞后，立即遭到细胞内酶的攻击，使其部分或全部失活。2，4-D浓度过高，导致外植体各部分间发生同化产物重新分配，从而影响机体的淀粉、核酸、蛋白质和酶等物质发生变化。

较高浓度的2，4-D虽然有利于愈伤组织的诱导，但不利于不定芽的分化。细胞分裂素BA、NAA等在愈伤组织诱导不定芽中起关键作用。张素芝等[10]认为，在培养基中添加适当浓度的细胞分裂素，有利于不定芽的分化。当细胞分裂素的浓度过高时，虽然愈伤组织分化不定芽的能力增强，但容易发生玻璃化和形成畸形的毛状根，不易成苗。细胞分裂素的浓度过低时，根比不定芽提前发生，且愈伤组织分化不定芽的能力显著下降。培养基中加入适当浓度的NAA和KT有利于生根。因此，植物激素的正确配比是大蒜离体培养的关键。

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