自体骨髓基质干细胞移植联合EPO治疗脊髓损伤的研究

【摘要】 目的：探讨自体骨髓基质干细胞（MSCs）移植联合促红细胞生成素（EPO）对大鼠脊髓损伤（SCI）治疗的效果。方法：培养与纯化骨髓基质干细胞。80只SD大鼠制备脊髓损伤模型，随机分为4组：干细胞移植组、EPO组、联合组和对照组。采用BBB法进行运动能力评分和组织切片观察来评定修复情况。结果：三个实验组与对照组相比，差异具有统计学意义（P

【关键词】 骨髓基质干细胞； 促红细胞生成素； 大鼠； 脊髓损伤； 修复

The Study on Autogeneic Esenchymal Stem Cells and Erythropoietin in Treatment of Spinal Cord Injury/YANG Guo-hong，ZHANG Chun-jun，ZHAO Fu-sheng，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（32）：001-003

【Abstract】 Objective：To evaluate the effects of transplantation of autogeneic mesenchymal stem cells（MSCs） with erythropoietin（ EPO） therapy after rats spinal cord injury（SCI）.Method：MSCs were cultured and purified in vitro.The rat model with spinal cord injury was prepared by modified Allen method.Eighty rats were put into four groups：stem cell transplation group， EPO treatment group， combination group and control group.The motor function was evaluated with BBB score and the neurological function recovery was observed by HE staining.Result：Statistical differences were showed in inter-group（P

【Key words】 Mesenchymal stem cell； Erythropoietin； Rat； Spinal cord injury； Repair

First-author’s address：Mudanjiang Medical College，Mudanjiang 157011，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.32.001

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是一种常见的神经系统损伤，其致残率和病死率均较高。目前，脊髓损伤在临床治疗后神经功能的恢复效果不甚理想[1-5]，急需改进，所以，脊髓损伤的治疗一直是医学研究的热点问题[6-7]。骨髓基质干细胞（MSCs）具有高度增殖和向多种细胞分化的潜能，可分化为对神经递质敏感且具有神经电生理特性的细胞，还可以产生多种神经生长因子促进受损的神经纤维修复，移植后可促进脊髓损伤的修复[8]，而且可以自体移植，因此骨髓基质干细胞是治疗脊髓损伤的理想种子细胞[9-10]。促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）是一种由肾脏产生的内分泌激素，一直作为治疗贫血的药物而应用于临床。随着人们对EPO研究的深入，EPO已被证实是一种新型的神经保护和营养因子，具有神经营养和神经保护作用[11]。本实验将骨髓基质干细胞和促红细胞生成素联合应用于脊髓损伤大鼠，探讨骨髓基质干细胞和促红细胞生成素联合应用是否有协同效应。

1 材料与方法

1.1 实验材料和设备 成年雄性SD大鼠80只，体重200～240 g；8周龄雄性SD大鼠4只，体重约100 g（均由哈尔滨医科大学动物试验中心提供）。二氧化碳细胞培养箱（德国Heraeus公司），倒置相差显微镜（日本奥林帕斯公司），低温离心机（德国Heraeus公司），单人双面净化工作台（苏州净化）超纯水净化器（美国Millipore公司），DMEM培养基，Percoll分层液。

1.2 实验方法

1.2.1 建立脊髓损伤模型与分组 8周龄的SD大鼠用于骨髓基质干细胞的分离、培养和纯化。成年SD大鼠水合氯醛麻醉后，俯卧位固定，找到T10棘突，向上和向下5 cm范围内进行剪毛消毒。沿正中线切一3 cm长的切口，暴露椎旁肌肉，用玻璃分针剥离肌肉，用骨钳咬除棘突和椎板，形成方形骨窗，暴露T10脊髓，用脊髓损伤打击器打击制成SCI模型。造模的标准是：脊髓出现出血、水肿、后肢迟缓性瘫痪和尾巴痉挛性摆动。冲洗切口后局部使用青霉素，以防感染，缝合后放回鼠笼喂养。按随机的方式将80只SCI模型的大鼠分为对照组、骨髓基质干细胞应用组、促红细胞生成素应用组和联合应用组，每组20只。对照组每只鼠在脊髓损伤前1 d经腹腔注射相同量的生理盐水。骨髓基质干细胞治疗组将每只鼠采取尾静脉注射的方法在脊髓损伤后给予第3代培养的骨髓基质干细胞单细胞悬液1 mL（1×106个骨髓基质干细胞）。促红细胞生成素治疗组的每只鼠在脊髓损伤前1 d经腹腔按每千克体重5000单位给予促红细胞生成素。联合治疗组每只鼠在脊髓损伤前1 d经腹腔按每千克体重5000单位给予促红细胞生成素，脊髓损伤后经尾静脉注射第3代培养的MSCs单细胞悬液1 mL（1×106个骨髓基质干细胞）。

1.2.2 指标检测 （1）大鼠后肢运动功能的BBB评分：采用Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）评分法 （全瘫计0分，正常计21分）[4]。分别于术前1 d，术后第7、14、21、28天取大鼠置于地板上，待大鼠开始连续行走时，采用双盲法观察后肢关节活动的范围和数量，根据双下肢步态协调以及运动程度进行评分，并记录。每只观察3～4 min，对各组鼠的双侧后肢的运动功能进行评分。（2）术后第1、28天行脊髓组织切片：分别将各组里5只大鼠麻醉后，在损伤脊髓处切取2个脊髓节段，将脊髓放入甲醛液中固定，放入冰箱过夜；取出脊髓置于含30%蔗糖的灌注液中至脊髓组织沉淀；然后进行石蜡固定，切片后行HE染色。

1.3 统计学处理 采用SPSS 12.0统计软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，组间比较采用方差分析、独立样本比较使用t检验，P

2 结果

2.1 大鼠后肢运动功能评分 采用BBB评分法，术前大鼠BBB评分均为21分，SCI后为0分。从表中可以看出：对照组、骨髓基质干细胞治疗组、促红细胞生成素治疗组和联合治疗组大鼠后肢运动功能随时间的变化而变化，表现为随着造模时间的推移四个组大鼠后肢的运动功能都是逐渐恢复，到第4周的时候每个组都有一定程度的恢复，与术前相比都有不同程度的改善。从手术后第7天起，四个组大鼠下肢功能存在明显的差别，联合组的分值最高，而对照组分值最低。术后7 d起，骨髓基质干细胞治疗组、促红细胞生成素治疗组和联合治疗组神经功能的BBB评分均明显高于对照组，差异有统计学意义（P

表1 各组大鼠各时间点后肢运动功能的BBB评分值 分

2.2 组织学变化 手术后1 d，对照组脊髓组织形态结构完好，神经细胞形态结构未见异常，没有肿胀等改变，细胞核大且圆，核仁清晰；其余三组脊髓组织内有点状或片状出血区，一部分神经元肿胀、空泡形成，核偏位，核仁较清晰。手术后28 d对照组脊髓组织内部神经元很少，有明显的空洞出现且形成大量瘢痕组织；骨髓基质干细胞治疗组与促红细胞生成素治疗组的脊髓组织局部出现空洞，有一些神经元；联合治疗组脊髓组织内空洞及瘢痕组织不明显，内含较多神经元，神经元胞体清楚、突起较多。

3 讨论

该试验中，笔者用BBB评分法对每只大鼠的神经功能情况进行评分，发现治疗后的第7、14、21、28天，大鼠下肢的运动功能随时间推移逐渐恢复，其中28 d时最为明显。三个实验组与对照组在第7、14、21、28天相比，差异均有统计学意义，EPO治疗组与BMSCs治疗组相比较，差异无统计学意义（P

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（收稿日期：2014-07-11） （本文编辑：陈丹云）