褪黑激素抗氧化作用的研究进展

摘 要：褪黑素对氧化应激反应的降低非常有效。它通过活性氧和活性氮物质的直接解毒手段实现这种作用，也可以间接通过结合褪黑素受体刺激抗氧化酶同时抑制促氧化酶的活性，或者螯合涉及Fenton / Haber-Weiss反应的过渡金属离子，减少破坏性毒性羟基自由基的形成，导致氧化应激的减少。在降低氧化应激能力方面，褪黑素的代谢产物也具有类似的功能。褪黑素在细胞内的普遍存在但不均等的分布，包括其在线粒体中的高浓度，可能有助于其抵抗氧化应激和细胞凋亡的能力。该文就褪黑激素的抗氧化作用研究进展作简要综述。

关键词：褪黑激素；抗氧化；自由基

中图分类号 R96 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）09-0024-04

Abstract：Melatonin is uncommonly effective in reducing oxidative stress under a remarkably large number of circumstances. It achieves this effect via direct detoxification of reactive oxygen species and active nitrogen substances. It can bind to the melatonin receptors which indirectly stimulate antioxidant enzymes and chelate transition metals which are involved in the Fenton/Haber-Weiss reactions；in doing so，melatonin reduces the formation of the devastatingly toxic hydroxyl radical resulting in the reduction of oxidative stress. The metabolic products of melatonin also have similar functions in reducing oxidative stress. Melatonin's ubiquitous but unequal intracellular distribution，including its high concentrations in mitochondria，likely aid in its capacity to resist oxidative stress and cellular apoptosis. In this paper，the progress of anti-oxidation of melatonin is briefly reviewed.

Key words：Melatonin；Antioxidant；Free radical

褪黑激素（melatonin，MT）是一种由哺乳动物松果体分泌的吲哚类激素，具有调节情绪、睡眠、免疫、、生殖及昼夜节律等多种生理功能。近年来研究表明，褪黑激素对衰老、肿瘤生长、慢性病以及老年病的发生和发展起着重要的调节作用。20世纪90年代初，Tan等[1]首次报道MT具有抗氧化作用，是一种高效的内源性自由基清除剂，能有效清除羟自由基、过氧亚硝基阴离子等活性氧。许多研究表明，MT的抗氧化作用是其抗衰老、预防老年病、预防慢性病发生的重要因素。

褪黑激素（melatonin，MT），是一种由松果腺分泌的吲哚类激素，其化学名称是N-乙酰基-5-甲氧基色胺。吲哚环上存在5-甲氧基和N-乙酰基，这两个基团是MT清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）的必需基团，其中5-甲氧基可以在生理状态下极大的增强MT捕获自由基的能力，且N-乙酰基可以保护MT不被单胺氧化酶降解。此外，MT结构稳定，没有游离的巯基和羟基，自身不容易发生氧化还原反应。MT是完全依赖向亲电子中间体和部分还原的缺电子生物大分子提供电子而发挥其抗氧化效应[2]，也就是说MT是提供电子来清除ROS的抗氧化剂。

1 褪黑素――调节其它抗氧化酶的活性

抗氧化物酶活性在正常光照下呈现内源性节律。随着时间的推移，这些周期性的改变可能取决于褪黑激素的昼夜节律。将动物暴露于恒定光照下，消除内源性褪黑激素节律性变化，发现该动物的抗氧化物酶活性夜间上升的现象消失。这说明褪黑素生理水平的变化足以改变抗氧化防御体系。众所周知，让动物连续暴露于光照下可以使其夜间褪黑素不再升高，这与鸡的几个组织中GSH-Px和SOD活性在夜间增加减少相关[3]。在其他啮齿动物也有类似的发现，由松果体切除术引起的褪黑激素缺乏可降低大鼠几种组织中的GSH-Px活性水平[4]。添加外源性褪黑素可以使大鼠和鸡的组织中GSH-Px、SOD的活性增强[5-8]。机体内褪黑激素的改变可以使抗氧化酶活性改变。

尹华祺探究了褪黑素对热应激小鼠的抗氧化作用，发现热应激时小鼠的总抗氧化能力、SOD酶活、GSH-Px酶活都降低，而MDA含量升高，这说明热应激已对小鼠的抗氧化体系造成损害，而褪黑素抗热应激的小鼠总抗氧化能力、SOD酶活、GSH-Px酶活均高于小鼠的生理水平，MDA含量t低于小鼠的生理水平，这表明了褪黑素能降低机体由热应激引起的氧化损伤[9]。代国杰发现褪黑素可以显著降低小鼠因脂多糖（LPS）导致的机体的ROS水平，提高机体的T-AOC水平，增强了机体抗氧化物酶SOD、GSF-Px的活性，提高机体的抗氧化能力[10]。洪汝涛、陈世林等人用褪黑素处理急性酒精性肝损伤大鼠，发现褪黑激素能显著升高抗氧化物酶SOD的活性，增强急性酒精性肝损伤大鼠的抗氧化能力[11]。当机体处于氧化应激条件时，外源性褪黑素可以是机体内抗氧化酶的活性和表达升高，以更好地保护机体免受自由基的氧化损伤。

有研究发现在多巴胺能神经元细胞系中添加褪黑激素，褪黑激素可以诱导合成一些新蛋白，而这些蛋白可以调节3种抗氧化酶Cu/ZnSOD，MnSOD和GSH-Px基因的表达。同时褪黑激素也使编码Cu/ZnSOD和GSH-Px的mRNA的半衰期减少，而不改变编码MnSOD的mRNA的半衰期[12]。这表明，培养基中的褪黑素可能诱导产生更多具有较短半衰期的mRNA的水平即前两种酶。最后，纳摩尔浓度的褪黑激素足以诱导抗氧化基因表达。如上所述，褪黑激素受体参与抗氧化酶基因表达调控的可能性极高。

颜赛梅通过培养Muller细胞，研究褪黑素及褪黑素受体调节抗氧化酶活性的作用机制，发现与正常生理条件相比较，高糖条件下Muller细胞的褪黑素膜受体（MT1/MT2）基因的表达量显著升高。同时发现在高糖条件下，细胞中核因子2相关因子（Nrf-2）和亚铁血红素氧化酶（HO-1）的表达量在添加褪黑激素组的表达量显著高于不添加褪黑素组，同时在细胞培养液中添加褪黑激素和褪黑激素受体拮抗剂luzindole与仅添加褪黑激素相比较，细胞中核因子2相关因子（Nrf-2）和亚铁血红素氧化酶（HO-1）的表达量显著减低[13]，这说明褪黑激素通过与褪黑激素受体结合，调控细胞内NRF-2因子，从而调控HO-1的活性。Nrf-2是一种重要的抗氧化因子，可以结合抗氧化反应元件（ARE）诱导大部分内源性抗氧化系统蛋白的表达，如亚铁血红氧化酶（HO-1）、硫氧化还原蛋白、谷胱甘肽（GSH）等，实现体内氧化还原的再平衡。蛋白激酶C磷酸化Nrf-2可能是其转录增加的关键步骤，对于氧化应激敏感的蛋白激酶途径，如MAPKs家族中的ERKs和P38等可能参与Nrf-2与抗氧化反应元件（ARE）的结合。褪黑素与褪黑素受体结合，活化Gq蛋白，激活质膜上的磷脂酶C，使质膜上PIP2水解成IP3和DAG。IP3与内质网上的IP3配体们钙通道结合，开启钙通道，使胞内钙离子浓度升高，胞内高浓度的钙离子和DAG可以激活蛋白激酶C（PKC），活化的PKC可以调节MAPK家族，从而调节抗氧化物酶的表达。

2 褪黑素――螯合重金属盐离子

尽管铜对于细胞生理是必需的，但当它处于高浓度时，它可以参与产生羟基自由基的Fenton/Haber-Weiss反应。由于细胞质内抗氧化酶铜超氧化物歧化酶（CuSOD）减少，导致铜的缺乏从而减弱了抗氧化防御进程。此外，一些神经疾病的共同特征是铜和/或其他金属的过量，其中包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、和肝性关节退化（Wilson病），这些条件中的一些相关的分子损伤可能是过量铜离子的促氧化作用的结果，所以调节铜等金属离子的水平与细胞需要一致是极为重要的。在1998年，使用吸收伏安法作为评估方法，Limson等[14]报道了褪黑激素可以结合铝，镉，铜，铁，铅和锌，就像金属硫蛋白。褪黑素与这些金属的相互作用是浓度依赖性的。褪黑激素参与芬顿反应的形式为螯合铁2+和铁3+。如果铁与蛋白质例如血红蛋白结合，褪黑激素可以将4价铁如血红蛋白氧化铁蛋白还原回3价铁，从而重新构建蛋白质的生物活性。这将类似于褪黑激素在遇到高毒性羟基时的还原作用。尤其是在大脑中，由于金属硫蛋白是蛋白质，金属产生的自由基会损害过渡金属与金属硫蛋白形成的任意结合键，使得金属硫蛋白在过渡金属结合方面起着较不重要的作用。相比之下，在大脑中褪黑素中和所产生的自由基并减少氧化损伤显得尤其重要。相对于血液中的浓度，CSF中高水平的褪黑激素可以为脑提供额外的氧化应激保护的可能性[15]。在脑中，褪黑激素除了其直接清除活性和间接抗氧化作用，可以替代或补充金属硫蛋白作为过渡金属的主要粘合剂。

Parmar等[16]研究了褪黑素降低肝脏匀浆中铜介导的脂质过氧化的能力。在这项研究中，褪黑激素可以通过直接清除足够的毒性自由基引发脂质过氧化降低脂质损害；通过电化学研究发现褪黑素结合Cu2+和Cu+，这些功能可能会降低肝脏脂质的氧化。Mayo等[12]研究发现褪黑素可以降低由Cu2+/H2O2引起的蛋白质损伤，而在比较研究中，Gulcin等人[17]发现褪黑激素具有比α-生育酚或合成抗氧化剂丁基化羟基丁基苯甲醚或丁基化羟基甲苯更高的Fe2+螯合活性。褪黑素还显着减少Al3+，Zn2+，Cu2+，Mn2+和Fe2+与淀粉样蛋白β肽的相互作用[18]。

在最近褪黑激素的金属螯合活性相关的研究中，发现褪黑激素结合铜离子时产生稳定的复合物有两种机制，直接螯合机制（DCM）和偶联去质子化螯合机制（CDCM）。在生理条件下，预测CDCM是Cu2+螯合的主要途径[19]。褪黑激素螯合Cu2+并完全抑制Cu2+/抗坏血酸混合物中诱导的氧化应激。褪黑激素也阻止了Fenton/Haber-Weiss反应中的初始步骤，从而降低了氧自由基的形成。在生物体中会发生金属催化产生分子损伤，褪黑素有螯合这些有害离子的能力。

3 褪黑素代谢产物抗氧化

褪黑激素的直接自由基清除活性已确定25a了。该过程的后续报告还确定了当褪黑素清除两种自由基时形成的一种新的褪黑素代谢物―环-3-羟基褪黑素C3OHM。研究发现C3OHM及其下游代谢物N-乙酰基-N-甲酰基-5-甲氧基神木胺（AFMK）和N-乙酰基-5-甲氧基神经胺（AMK）都是褪黑素的抗氧化相关物，他们以及褪黑素都可以减缓分子，细胞和组织，包括人类细胞的氧化损伤[20-22]。因此，褪黑激素的第一代，第二代和第三代代谢物都已被证明是极好的自由基清除剂。褪黑激素的这些级联产物可能使其能够清除多达10种自由基产物，这与对单个氧化分子解毒的经典自由基清除剂形成鲜明的对比。

研究l现褪黑激素以及其代谢物C3OHM，AFMK和AMK都具有螯合铜的能力，降低氧化应激。通过比较褪黑激素、C3OHM、AFMK和AMK的螯合铜能力，发现褪黑激素及其代谢物结合铜离子机制是一样的[23]，在生理条件下，预测CDCM是Cu2+螯合的主要途径。褪黑激素及其代谢物螯合Cu2+并完全抑制Cu2+/抗坏血酸混合物中诱导的氧化应激[19]。类似地，褪黑激素、C3OHM和AFMK阻止了Haber-Weiss反应中的初始步骤，从而降低了氧自由基的形成。在这些发现的基础上，褪黑激素除了作为自由基清除级联反应中的初始分子，也参与金属螯合级联反应[24]，从而降低机体内由金属离子引起的氧化损伤。

4 褪黑素――线粒体的靶向抗氧化剂

在正常需氧细胞中，线粒体发生氧化磷酸化产生大量ATP供细胞正常所需外，也产生大量的活性氧，与此同时细胞中也有一些常规的抗氧化剂来抵消ROS。但是这些常规的抗氧化剂不能在线粒体中大量存在，如内源性辅酶Q10和S生素E。为实现他们在线粒体中的大量存在，辅酶Q10和维生素E需要与亲脂性焦磷酸磷铵素阳离子（TPP）共轭[24，25]。TPP与Q10或维生素E的共轭物MitoQ或MitoE可以快速穿过细胞和线粒体膜，并且结合的物质在线粒体积聚的浓度比未结合的抗氧化剂高达几百倍。而褪黑素可以自由快速穿过线粒体膜，在线粒体中发挥直接抗氧化功能。Lowes等人比较了褪黑素与两种线粒体靶向抗氧化剂MitoQ和MitoE在减少氧化损伤中的相对作用，发现这3种物质在减少氧化损伤和抑制促炎细胞因子方面具有相同的保护作用[26]。褪黑素可以像MitoQ和MitoE一样快速穿过细胞和线粒体膜，并且在线粒体中积聚结合的的浓度比常规的抗氧化剂高达几百倍，是线粒体的靶向抗氧化剂。这将与褪黑素水平在肝线粒体中比血浆线粒体中高得多结果一致[27，28]，这与线粒体可能是细胞内褪黑激素合成的位点的设想一致[29]。褪黑素在线粒体中的定位可能是其强抗氧化活性的的关键。

褪黑素对氧化应激反应的降低非常有效。它通过活性氧和活性氮物质的直接解毒手段实现这种作用，也可以间接通过结合褪黑素受体刺激抗氧化酶同时抑制促氧化酶的活性，或者螯合涉及Fenton/Haber-Weiss反应的过渡金属离子，减少破坏性毒性羟基自由基的形成，导致氧化应激的减少。在降低氧化应激能力方面，褪黑素的代谢产物也具有类似的功能。褪黑素在细胞内的普遍存在但不均等的分布，包括其在线粒体中的高浓度，可能有助于其抵抗氧化应激和细胞凋亡的能力。

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