蒙药娜仁满都拉-11抑制胃肿瘤增殖及其机制的实验研究

【摘要】 目的 研究蒙药娜仁满都拉-11对大鼠种植性胃肿瘤增殖及相关细胞周期蛋白表达的影响；从细胞分子水平探讨该药的抗肿瘤作用机制。方法 建立Walker-256种植性胃肿瘤大鼠模型。再将肿瘤鼠随机分为3组：娜仁满都拉-11治疗组670 mg/(kg•d)、阴性对照组(生理盐水组)、阳性对照组(5-FU组)。给药(灌胃)2周后取出瘤组织，测其抑瘤率；免疫组化方法检测种植瘤cyclin D1表达；流式细胞术测定种植瘤细胞周期时相分布情况。结果 ①与阴性对照组比较，治疗组 cyclin D1表达下调(P

【关键词】蒙药娜仁满都拉-11；种植性胃肿瘤；细胞周期蛋白cyclinD1

e Na Ren Man Du La-11 depressing the proliferation of gastric tumor and its mechanism

WU YUN Gao-wa，LIU Shu-ping，WANG Hai-sheng，et al.Department of oncology medicine,Inner Mongolia Hospital.Huhhot 010017,China

【Abstract】 Objective TostudytheeffectofNa Ren Man Du La-11onthe proliferation ofimplantedmice gastric tumorand on the cell cycle protein; To explore the function mechanism of the medicine at cell molecular level.MethodsTobasedmicemodelsofthecell line Walker-256 implantedgastric tumor.We dividedmicetumorintothree groups：①the treatment group ofMongoliamedicine Na Ren Man Du La-11 670 mg/(kg•d),thegroupofthenegative control(0．9%NaCl),thegroupofpositive control(5-FU).2 weekslatertumortissueswerecutoff,we mensuratedto depress tumorrate ; Theexpressionofexamedimplantedtumorcyclin D1 byusedimmunohistochemically; We examedimplantedtumor thecell cycledistributing byflowcytometry.Results ① Comparedwiththe negativecontrolgroup,the treatment group had down-regulationofcyclinD1(P

【Key words】Na Ren Man Du La-11; Implanted gastric tumor; CyclinD1

娜仁满都拉-11又叫升阳11味丸，是由肉桂、石榴、白叩、小蜀季花、黄精、天门冬、天花粉、蒺藜、蓖拨、红花、玉竹11味单方蒙药组成的复方制剂，其中已有天花粉等成分抑制肿瘤的文献报道[1-4]。临床上常用来治疗胃寒，消化不良，浮肿，肾寒，腰痛，遗精淋下，寒性腹泻。此前邓秀玲等对它进行了体外研究[5]证实娜仁满都拉-11抑制胃肿瘤MGC-803细胞的生长，影响其细胞周期分布时相，使S期细胞比率增加，G0/G1期细胞比率减少。王海生，彭洪涛等对该复方蒙药体内抗肿瘤的研究结果显示娜仁满都拉-11明显诱导肿瘤细胞凋亡，增强抗肿瘤免疫应答。在此基础上，本实验以Walker-256癌肉瘤细胞复制大鼠种植性胃肿瘤模型，从细胞周期方面对该药进行体内研究，进一步探讨娜仁满都拉-11在体内抗肿瘤机制。

1 实验材料与方法

1．1 实验动物 纯系Wistar大白鼠50只，鼠龄8周，雄性，体质量（190±15）g，购自内蒙古大学动物中心。

1．2 Walker-256癌肉瘤细胞株购自中国医学科学院药物研究所。

1．3 药品

1．3．1 蒙药娜仁满都拉-11由内蒙古中蒙医院制剂室提供。

1．3．2 氟脲嘧啶片(5-FU)山西鑫煜制药有限公司生产 购自附属医院药房。

1．4 主要试剂与仪器。

1．4．1 免疫组化SP试剂盒 购自福洲迈新试剂公司。

1．4．2 CyclinD1 兔抗鼠抗体购自武汉博士德试剂公司。

1．4．3 PI染料 Sigma公司生产。

1．4．4 流式细胞仪 Epics-XLⅡ型，美国Beckman Coulter。

2 实验方法

2．1 模型的建立与实验分组 将冻存的Walker-256腹水复苏呈液态,在清洁条件下注入Wistar大白鼠腹腔内。1周后将形成的腹水模型鼠腹水与生理盐水按1∶1混合后，注射在 Wistar大白鼠后肢皮下，7~10 d即可形成皮下实体瘤，将其剥取，剪成约0．5 mm×0．1 mm大小的组织碎片,在10 g/L异戊巴比妥钠(4 ml/kg)腹腔麻醉下，塞入Wistar大白鼠胃壁浆肌层隧道内,第8天按原切口进入腹腔，可见鼠胃种植区形成大小不等的肿瘤。将成功的胃肿瘤模型鼠随机分为3组(每组8只)：670 mg/（kg•d）(蒙药治疗组)，等体积生理盐水(阴性对照组)，5-FU 20 mg/(kg•d)(阳性对照组)。从胃肿瘤模型成功次日开始，灌胃1次/d，连续10 d。

2．2 观察指标

2．2．1 光学显微镜下观察种植性胃肿瘤的瘤细胞与腹水、种植性实体瘤细胞同源。瘤细胞形状不规则，胞核大而深染，胞核呈多形性，瘤细胞增生活跃，细胞排列紊乱，保持了原有的瘤细胞的特点。

2．2．2 抑瘤率

给药第11天(即末次给药后第2天),处死大鼠,剥离瘤体后称重(Ｗ),计算抑瘤率(I)，I=(对照组Ｗ-治疗组Ｗ)/对照组Ｗ×100%。

2．2．3 免疫组化检测 免疫组化染色:免疫组化检测采用SP法。每批实验用已知阳性切片做阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。结果判断：CyclinD1为胞核着色，标本胞核内出现棕黄或棕黑色颗粒，且强度高于本底为阳性细胞。阳性细胞表达强度可用它们的光密度来表示，并使用JD801图象分析软件分析表达强弱情况。

2．2．4 流式细胞术检测 首先将固定在70%乙醇中的肿瘤组织制备成单细胞悬液。PI染色：取1 ml悬液(1×105个细胞)，加入碘化丙啶(PI)(PI：50 mg/L,0．5%triton-x100,10 μg/ml RNaseA,2．5 mmol/L柠檬酸钠)1 ml,在4℃染色30 min，3 h内即可上机检测。

2．3 数据统计 实验数据以SPSS11．0统计软件对实验数据进行统计分析，用均值±标准差表示。多个样本均数比较选用单因素方差分析(One-way ANOVA0)、两两比较选用最小显著差法(Leastsignificantdifference，LSD)；P

3 实验结果

3．1 瘤重、抑瘤率

表1示娜仁满都拉-11治疗组670 mg/(kg•d)和5-FU组瘤重明显低于生理盐水组且有统计学意义(P

3．2 免疫组化结果 表2示5-FU组、蒙药治疗组的CyclinD1表达水平均较生理盐水组减少，即胞核棕染的阳性细胞较生理盐水组减少且差异有统计学意义(P0．05)。

3．3 流式细胞仪检测细胞周期分布结果

表3显示与生理盐水组比较5-FU组、蒙药治疗组肿瘤细胞在S期的比例下降而G0/G1期的比例增高,差异有统计学意义(P0．05)。

4 讨论

真核细胞的分裂周期遵循G1期S期G2期M期的演变规律。在这个演变过程中存在多个限制点，其中G1S和G2M为两个重要的限制点，调节各时相的切换及细胞周期进程,而前者尤为重要。G1S期限制点决定着细胞是继续增殖还是进入G0期,或永久离开细胞周期进入终末分化死亡。本研究显示娜仁满都拉-11治疗组和5-FU组，肿瘤细胞处于G0、G1期的比例高于生理盐水组,处于S期细胞的比例低于生理盐水组(P

CyclinD1基因定位于染色体llq13，编码的蛋白由295个氨基酸组成，后者在G1S期转换中发挥着重要的正性调控作用，其表达失控有可能引起细胞异常增殖而发生肿瘤。目前已发现CyclinD1在人类许多肿瘤[6-10]中存在过表达现象。是已被证实的与肿瘤有直接关系的癌基因。本实验采用免疫组化方法检测鼠种植性胃肿瘤CyclinD1表达结果显示,娜仁满都拉-11治疗组肿瘤细胞CyclinD1表达强度均低于生理盐水组(P0．05)，表明娜仁满都拉-11和5-FU有一定的下调CyclinD1表达的效应，从而抑制肿瘤细胞增殖。

综上所述，娜仁满都拉-11对Walker-256大鼠胃种植性肿瘤有一定的抑制作用，这与前期研究数据相接近。该蒙药抗肿瘤机制可能是以CyclinD1为作用靶点，即通过抑制细胞CyclinD1蛋白表达，影响细胞周期G1/S调控点，阻止肿瘤细胞由G1期向S期转变，使细胞停留在G0/G1期，从而对肿瘤细胞起抑制作用。因此，本研究为该蒙药的进一步筛选，开发利用及选择最适剂量提供了理论与实验依据，同时为抗癌蒙药临床应用探索一条可能的途径。

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