手足口病病原学及其诊断研究进展

摘要：手足口病是一种儿童常见传染病，该病播散快、流行性强，可在短时间内造成大规模流行，严重威胁儿童的身体健康。2008年5月2日，我国卫生部正式将手足口病列入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。引起手足口病的肠道病毒有很多种，并且不同病毒感染所致手足口病的疾病过程不同，早期发现手足口病尤其是重症病例，并给予积极综合处理是治疗成功的关键，因此，快速、特异的病原学诊断显得尤为重要，在此对手足口病病原组成及病原学诊断方法等研究进展进行简要概述。

关键词：手足口病；肠道病毒；病原学诊断

手足口病（Hand，foot and mouth disease，HFMD）是一种由多种肠道病毒引起的急性传染病，多发生于儿童，尤其是

1手足口病病原组成

肠道病毒（enterovirus，EV）为单股正链RNA，属于小RNA病毒科，肠道病毒属，包括脊髓灰质炎病毒（poliovirus，PV）、柯萨奇病毒A组（Coxasckie virus A，CA）、柯萨奇病毒B组（CB）、埃可病毒（Echovirus，ECHO）、新型肠道病毒[2-3]。引起HFMD的致病原为柯萨奇病毒A组2、4、5、6、7、9、10、14、16型，B组1、2、3、4、5、13型，埃可病毒3、4、6、9、11、13、19、24、30型和EV71、EV80、EV84等。

手足口病是一种全球性的传染病，1957年新西兰首次报道该病，1958年分离出柯萨奇病毒，1959年提出手足口病命名，1969年EV71在美国被首次分离出来。我国于1981年在上海首次报道HFMD[4]，以后各地均有报道，EV71感染与CA16感染交替出现，成为手足口病的主要病原体[5]。近年来HFMD的病原型别存在一定变化，各地流行病原以EV71和/或CA16为主，同时发现一定比例的其他肠道病毒存在。杨晓红[6]等对2010年昆明地区HFMD的流行特征研究发现，人肠道病毒检出8200例，总阳性率为61.72%，其中EV71占29.49%，CA16占53.21%，EV71和CA16混合感染占0.19%，肠道病毒其他型占16.39%。王海岩[7]等对泰安市2003年肠道病毒感染引起的传染病暴发的研究中发现，患者临床症状以HFMD为主，ECHO19和EV71型病毒是分离到的最主要的肠道病毒，可能为大部分患者的病因。张寿斌[8]等对237例HFMD病例标本进行RT-PCR检测，结果病原体以EV71、CA16为主，另有CA5、ECHO13。张晓丽[9]对2007年山东省3038例手足口病住院患者进行病原学检测，结果显示，病原以EV71为主，同时存在CA16和ECHO3等其他肠道病毒。朱冰[10]等采集疑似手足口病患儿咽拭子标本1023例，进行TaqMan荧光RT-PCR检测，结果显示EV71型276例，CA16型126例，EV84型4例，ECHO11型3例，ECHO9型2例，CB3型3例，CA10型4例，CA6型3例，CA12或A5型6例。吴涛[11]等对在徐州地区采集的19份手足口病临床标本进行病原学分离与鉴定，19份标本中分离到9株病毒，均为肠道病毒，6株为CB5，1株为CB3、2株为ECHO6。王永全[12]等收集2009年4月～12月检测为非EV71、非CA16型肠道病毒的手足口病患者咽拭子标本45份，用巢式RT-PCR进行分子型鉴定，结果显示，2009年北京市HFMD病原除EV71和CA16外，还包括CA2、CA4、CA5、CA6、CA9、CA10、CA12、CB5、ECHO11，其中CA10为优势病毒型别。肖红[13]等对广东省2008-2009年22份手足口病病例标本进行RT-PCR检测，结果显示，手足口病病原除了EV71和CA16占主导地位外，其他型肠道病毒分布比较广，既有CA组、CB组，也有ECHO13、ECHO24、ECHO30、新型肠道病毒EV80和脊髓灰质炎病毒（Poliovirus，PV）。马智龙[14]等对引起一起手足口病聚集性疫情的未分型肠道病毒进行病原学鉴定，结果为CB4。张晓玲[15]等对上海部分地区440例临床手足口病病例进行病原谱分析，结果显示，引起手足口病的肠道病毒主要为EV71、CA16，其次为CA6和CA10。2009年，吉彦丽[16]等采集HFMD重症病例咽拭子标本35份，进行实时荧光RT-PCR检测，结果显示13例EV71阳性，2例CA16阳性，12例其他肠道病毒阳性，分别为：CA2、CA4、CA5、CA6、CA10、CB5、Echoll、人鼻病毒。1997年在马来西亚暴发的手足口病的病原主要为ECHO1、CA9和EV71[17]。ECHO7在2000年被发现为手足口病的一种病原[18]。Denise Hage RUSSO[19]等研究发现，ECHO4也是引起手足口病的一种病原。V.Gopalkrishna[20]等研究发现，在印度，CA16和CA6是引起手足口病的主要病原，其他病原体有：CA10、EV71和ECHO9。CA7和CA14也曾引起过手足口病的散发[5，21]。

2手足口病病原学诊断

2.1病毒分离培养及血清型鉴定 利用组织培养技术从感染部位或传染源分离出病毒并鉴定其特异性血清型是实验室诊断病毒感染的"金标准"。

病毒分离成功的关键在于选取病毒滴度高的标本和敏感性强的细胞。粪便标本是最常采集的标本。常用的分离方法有动物接种法和细胞培养法。动物接种法是肠道病毒诊断最早的实验手段，常用小鼠或乳鼠进行腹腔或脑内接种，观察其发病情况，以判断标本是否有病毒存在，该方法操作比较繁琐，动物个体差异大，所测得的结果不够稳定，目前该法较多用于科学研究。细胞培养法用于分离病毒的细胞系为人横纹肌肉瘤细胞系（RD）、人喉癌上皮细胞系（Hep-2）、人肺癌细胞系（A549）、人肺细胞系（MRC-5）、海拉细胞系（Hela）、猴肾细胞系（LLC-MK2）、非洲绿猴肾细胞系（Vero）等[22-25]。2种或2种以上细胞同时使用有助于分离到更多的肠道病毒。对一些不能在细胞上生长的病毒，可用乳鼠接种分离。病毒分离之后可应用组合血清和/或特异性血清进行中和试验定型。目前常用的Lim Benyesh-Melnick（LBM）组合血清（A-H）可鉴别42个型EV。如果未鉴定成功，可再用另外含19个型CAV抗体组合（J-P）进行鉴定。

病毒在标本中的滴度以及其在分离体系中生长适应性，分离操作的外环境等可对分离结果产生影响，同时，病毒培养耗时较长，无法满足病毒流行期间同时处理大量标本的需要，由此可见，病毒分离培养法敏感性欠佳，但对于一些含有PCR抑制因素的样品来说，病毒分离培养法也许是唯一的PCR法不能取代的检测方法。

2.2血清学检测 血清学检测是利用抗体和其对应抗原之间发生专一反应的一种检测方法，包括中和试验（neutralization test）、酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）、免疫荧光试验（immunofluorescence test）和补体结合试验（complement fixationtest，CF）等。

肠道病毒特异性鉴定主要靠中和试验，即微量板法测定抗体滴度。如果检测急性期患者血清异性IgM抗体阳性，或急性期与恢复期血清（病后一个月左右）IgG抗体有>4倍升高，可为实验室诊断病例[26]。但病毒颗粒的完整性、抗血清滴度的强弱、宿主细胞的敏感性等各因素的变化都会影响其结果的准确性，而且整个实验需早期感染血清和恢复期血清判断实验结果，所需时间较长，故不适用于早期快速诊断，同时对检测人员技术要求较高，不适用于临床检测，多用于流行病学研究。ELISA是利用酶标记抗体后仍能与相应的抗原形成免疫复合物的原理，经底物显色后可观察结果，包括间接法、双抗体夹心法、双抗原夹心法、捕获法和生物素亲和素法、膜酶免疫试验和微孔腊免疫试验、竞争性抑制等多种方法。利用ELISA捕捉法或间接法检测早期患者血清中的IgM和IgG抗体，是常用的手段。ELISA法相对而言简便、快速，不需要专业的技术人员，且对实验室的要求也不高，但是ELISA法的敏感性低于PCR法。

2.3分子生物学方法

2.3.1病原学诊断

2.3.1.1核酸杂交技术核酸杂交分为原位杂交（insitu hybridization）、斑点杂交（dot blot）、转印杂交（Southern blot、Northern blot）等。该技术是将同位素或生物素标记的探针与患者标本中提取的病毒RNA进行杂交，进行定性、定量分析，该技术的敏感性较高。

2.3.1.2 PCR方法PCR技术已成为诊断肠道病毒感染最常用的一种方法，是目前灵敏度最高的RNA检测技术。PCR方法可分为RT-PCR、实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR）、TaqMan荧光定量RT-PCR、半套式RT-PCR、巢式PCR、半巢式PCR法等。RT-PCR法是以RNA为模板逆转录成互补DNA（cDNA），再以该链为模板进行PCR反应，可检测出单个细胞中

2.3.1.3 PCR联合芯片技术芯片技术可以同时准确进行多个病毒分型，假阳性率较低，Chen[27]等应用RT-PCR联合芯片技术检测HFMD标本144例，然后应用real-time PCR分析，最后用中和试验证实，结果发现，RT-PCR联合芯片技术对EV71和CA16的诊断准确率分别为92.0%和95.8%。这一高度敏感的以芯片为基础的检测方法有望在不久的将来广泛应用于临床。

2.3.2病原型别鉴定 肠道病毒为单股正链RNA，长约7-8kp，编码一多聚蛋白，基因组的5'末端至3'末端依次排列着5'UTR、编码区（P1、P2、P3）、3'末端和多聚A尾。P1区编码主要的结构蛋白，终产物为VP1-VP4，VP1-VP3暴露在病毒颗粒表面，VP4在病毒颗粒内部，由于P1区组内重组频率较低，因此VP1、VP2、VP4为目前肠道病毒分子分型的主要研究对象。

在检测肠道病毒感染的过程中，从标本中提取RNA后，应用相应的引物进行扩增，用以确定病毒的类型或亚型。引物可分为两类，一类为通用引物，由于肠道病毒各血清型之间的核酸序列在5'非编码区（5'-NCR）高度保守，因此可以在此设计能检测到大多数肠道病毒的通用引物，如CCCTGAATGCGGC

TAATCC，ATTGTCACCATAAGCAGCCA，AACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTT

TC；另一类为分型引物，主要基于VP1基因序列设计，如012：5'ATGTAYGTICCICCIGGIGG3'，040：5'ATGTAYRTICCIMCIGGIGC3'，011：5'GCICCIGAYTGITGICCRAA3'等，012-011可扩增CB和ECHO，040-011可扩增CA和部分ECHO。对于EV通用引物扩增结果为阳性的标本可再用分型引物进行扩增、测序，把VP1基因序列结果出入GeneBank，用Blast程序进行相关序列比较[28]。

参考文献：

[1]Wu YD， Shang SQ， Chen ZM， Yang ZH. Analysis of the epidemic characteristics of the etiological agents in children with hand，foot and mouth disease and its clinical significance[J].Zhonghua Er Ke Za Zhi，2010，48（7）：535-9.

[2]M.Steven Oberste， Kaija Maher， Mark A. Pallansch. Evidence for Frequent Recombination within Species Human Enterovirus B Based on Complete Genomic Sequences of All Thirty-Seven Serotypes.Journal of Virology[J].Journal of Virology，2004，p.855-867.

[3]Christina Tryfonos， Jan Richter， Dana Koptides， et al. Molecular Typing and Epidemiology of Enteroviruses in Cyprus，2003-2007[J].J Med Microbiol，2011，60（Pt 10）：1433-40.

[4]Zheng ZM， He PJ， Caueffield D， et al. Enterovirus 71 isolated from China is serologically similar to the prototype EV71 BrCr strain but differs in the 5'-noncoding region[J].J Med Virol，1995，47（2）：161-167.

[5]Ang， L.W.， Koh， B.K.W.， Chan， K.P.， et al. Epidemiology and control of hand，foot and mouth disease in Singapore，2001-2007[J].Ann Acad Med Singapore，2009，38，106-112.

[6]杨晓红，等.2010年昆明地区手足口病的流行特征[J].中国当代儿科杂志，2012，14（3）：192-194.

[7]王海岩，等.一起传染病暴发中肠道病毒血清型鉴定和ECHO30基因特征分析[J].病毒学报，2005，21（2）：106-112.

[8]张寿斌，等.深圳237例手足口病肠道病毒血清型基因及临床特征[J].中国当代儿科杂志，2008，10（1）：38-41.

[9]张晓丽.临沂市手足口病流行状况及防制对策分析[J].社区医学杂志，2008，6（13）：11-12.

[10]朱冰，等.2008年广州地区手足口病的病原学研究[J].中华儿科杂志，2010，48（2）：127-130.

[11]吴涛，等.19份手足口病临床标本的病原学分离与鉴定[J].江苏预防医学，2010，21（6）：1-3.

[12]王永全，等.北京地区与手足口病相关的非EV71非CA16型肠道病毒的分子特征分析[J].国际病毒学杂志，2011，18（3）：75-79.

[13]肖红，等.2008-2009年广州手足口病非EV71非CA16肠道病毒株的鉴定及其VP1基因序列分型研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，2011，31（9）：808-812.

[14]马智龙，查杰.一起由肠道病毒CoxB4引起的手足口病聚集性疫情的病原学鉴定及其基因型分析[J].中国卫生检验杂志，2011，21（10）：2361-2363.

[15]张晓玲，等.2010年上海部分地区440例手足口病病例的病原谱及分子流行病学分析[J].微生物与感染，2011，6（4）：214-224.

[16]吉彦丽，王永全.手足口病重症病例特征分析及其病原型别分子鉴定[J].现代预防医学，2012，39（11）：2817-2819.

[17]Abubakar， S.， Chee， H.Y.， Shafee， N.， et al. Molecular detection of Enteroviruses from an outbreak of hand，foot and mouth disease in Malaysia in 1997[J].Scand.J.infect.Dis.，1999，31：331-335.

[18]Chua， B.H.， Mcminn， P.C.， Lam， S.K.， et al. Comparison of the complete nucleotide sequences of echovirus 7 strain UMMC and the prototype（Wallace）strain demonstrates significant genetic drift over time[J].Gen.Virol，2001，82：2629-2639.

[19]Denise Hage RUSSO， Adriana LUCHS， Braulio Caetano MACHADO， et al. Echovirus 4 associated to hand，foot and mouth disease[J].Rev.Inst.Med.trop.S.Paulo，2006，48（4）：197-199.

[20]V. Gopalkrishna， Pooja R. Patil， Gajanan P. Patil， et al. Circulation of multiple enterovirus serotypes causing hand，foot and mouth disease in India[J].Medical Microbiology，2012，61，420-425.

[21]Podin，Y.， E.L. Gias， F. Ong， Y.W. Leong， et al. Sentinel surveillance for human enterovirus 71 in Sarawak，Malaysia：lessons from the first 7 years[J].BMC Public Health，2006，6：180.

[22]Ooi MH， Solomon T， Podin Y. Evaluation of different clinical Sample Types in Diagnosis of human enterovirus 71-associated hand-foot-mouth disease[J].J Clin Microbiol，2007，45（6）：1858-1866.

[23]Brown BA， Kilpatrick DR， Oberste MS， et al. Serotype-specific indentification of enterovirus 71 by PCR[J].J Clin Virol，2000，16（2）：107-112.

[24]Tan EL， Chow VT， Kumarasinghe G， et al. Specific detection of enterovirus 71 directly from clinical specimens using real-time RT-PCR hybridization probe assay[J].Mol Cell Probes，2006，20（2）：135-140.

[25]缪志潇.关于肠道病毒检测技术的研究[J].医学前沿，2012，2（12）：359-360.

[26]刘映霞，周伯平.肠道病毒71相关性手足口病新进展[J].中华实验和临床感染病杂志，2010，4（1）：71-75.

[27]Chen TC， Chen GW， Hsiung CA， et al. Combining multiplex reverse transcription-PCR and a diagnostic microarray to detect and differentiate enterovirus 71 and coxsackievirus A16[J].J Clin Microbiol，2006，44：2212-2219.

[28]Oberste MS， Mihele SM， Maher K， et al. Molecular identification and characterization of two proposed new enterovirus serotypes，EV74 and EV75[J].J Gen Virol，2004，85：3205-3212.